药用植物代谢组学研究

段礼新　代云桃　孙超　陈士林

[摘要] 代谢组学是全局性研究小分子代谢物的一门科学，是系统生物学的重要组成部分，广泛应用于中医药复杂体系。代谢物是药用植物代谢合成的产物，是中药发挥疗效的物质基础。随着本草基因组计划的实施和中药合成生物学的发展，药用植物代谢组学研究将会迎来蓬勃发展。该文介绍代谢组学技术近几年的研究进展，以及药用植物代谢组学研究的主要内容，包括药用植物鉴别和质量评价，品种选育和抗逆研究，代谢途径解析，代谢网络、代谢工程研究及合成生物学研究。通过整合本草基因组，转录组和代谢组学等研究，最终为药用植物品种选育、创新药物研发和质量安全性评价奠定基础。

[关键词] 代谢组学； 药用植物； 分析技术； 次生代谢； 代谢途径

Metabolomics research of medicinal plants

DUAN Lixin1， DAI Yuntao2， SUN Chao3， CHEN Shilin2*

（1.Institute of Botany， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100093， China；

2.Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

3.Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union

Medical College， Beijing 100193， China）

[Abstract] Metabolomics is the comprehensively study of chemical processes involving small molecule metabolites. It is an important part of systems biology， and is widely applied in complex traditional Chinese medicine（TCM）system. Metabolites biosynthesized by medicinal plants are the effective basis for TCM. Metabolomics studies of medicinal plants will usher in a new period of vigorous development with the implementation of Herb Genome Program and the development of TCM synthetic biology. This manuscript introduces the recent research progresses of metabolomics technology and the main research contents of metabolomics studies for medicinal plants， including identification and quality evaluation for medicinal plants， cultivars breeding， stress resistance， metabolic pathways， metabolic network， metabolic engineering and synthetic biology researches. The integration of genomics， transcriptomics and metabolomics approaches will finally lay foundation for breeding of medicinal plants， R&D， quality and safety evaluation of innovative drug.

[Key words] metabolomics； medicinal plants； analytic technology； secondary metabolism； metabolic pathway

doi：10.4268/cjcmm20162202

植物在长期的进化过程中，产生了数量庞大、结构迥异的小分子代谢物。这些物质在植物生长发育和适应环境方面发挥着重要的作用，同时也是人类营养成分和药物的重要来源。药用植物是人类数千年来筛选出来的用于防病、治病的植物，我国药用植物有1万多种，约占中药资源总数的87%[1]。药用植物生物合成结构多变、活性多样的次生代谢产物，它们通常是中药材的药效物质基础，是新药、新化学实体的重要来源。同时，合成这些重要天然产物的基因，调控因子以及代谢网络更是一个尚未有效开发的巨大资源宝库。随着本草基因组计划（herb genome program，HerbGP）的实施[1]，无疑将吸引更多、更新的生命科学技术的跟进，给药用植物次生代谢研究注入强劲动力。

代谢组学（metabolomics或metabonomics）旨在研究生物体或组织甚至单个细胞的全部小分子代谢物成分及其动态变化，进而在全局水平上解析代谢网络与调控[24] 。代谢组学是系统生物学重要组成部分，是从整体的层面上研究代谢变化。代谢组学从2000年左右提出概念，到现在（特别是最近几年）保持快速的发展势头（图1）。代谢物是中药发挥作用的载体，代谢组学在中医药复杂体系有着非常广阔的应用。截至写稿前，代谢组学在中医药领域发表526篇相关中文文献（CNKI检索结果），在中药材基原鉴别[5]，药材道地性[6]，药材的质量控制[7]，中药炮制[8]，中药有效成分研究[9]，中药复方配伍[10]，中药药效、药理评价[11]，中药代谢及毒理评价[12]，中药方证[13]等领域有着广泛的应用（图2）。

数据以“metabolomics” 或 “metabonomics”为关键词检索ISI Web of Science数据库所获得。

图1 代谢组学相关论文年发表数量统计

Fig.1 The annual number of metabolomics or metabonomics paper

数据以“代谢组学”为关键词检索CNKI数据库，限定“中药”和“药学”领域所获得。

图2 代谢组学在中药学和药学领域中文文献统计分析

Fig.2 Statistic analysis of the applications of metabolomics/metabonomics in traditional Chinese medicine

药用植物代谢组学是以药用植物为研究对象，采用各种分析化学手段，全局性分析药用植物小分子代谢产物，从整体上定性、定量测定基因或环境对代谢物的影响，从而解析代谢物的代谢合成途径、代谢物网络及调控机制。研究通常结合基因组信息，各种分子生物学和组学手段，如转录组学、蛋白组学、分析化学、化学计量学等手段。研究内容主要包括药用植物的鉴别和质量评价，药用植物品种选育及抗逆研究，初生、次生代谢途径解析，代谢网络、代谢工程研究及合成生物学研究等几个方面，最终为药用植物品种选育、创新药物研发和质量安全性评价奠定基础。本文主要介绍代谢组学技术的最新进展，及在药用植物代谢途径、代谢工程和合成生物学研究（图3）。

图3 药用植物代谢组学研究

Fig.3 The metabolomics research of medicinal plants

1 代谢组学分析技术进展

代谢组学研究的基本步骤包括：实验设计，植物栽培，取样，样本制备，衍生化，检测分析，数据分析，代谢途径或代谢网络分析。代谢物的种类和含量除受到遗传和环境两方面的影响，也与样本提取和制备关系极大。好的代谢组学分析，要保持各种实验条件一致。例如在分析突变体和野生型材料时，突变体要回交数代，保持遗传背景与野生型相同。还要在相同的条件下栽培，选取同一生理时期、相同组织部位的材料，代谢物提取方法要保持一致，这样的代谢组学数据才具有可比性。代谢组学技术在不断发展，研究热点多集中在各种新的分析检测技术的开发，海量数据处理软件的研发以及代谢途径、代谢网络、代谢数据库的构建等。下面重点介绍代谢组学技术近几年的研究进展。

多平台整合代谢组学分析，代谢组学技术主要包括核磁共振谱（nuclear magnetic resonance，NMR）平台和质谱（mass spectrometry，MS）平台。NMR具有简单的样品预处理、较高的重现性和良好的检测客观性等优势，但是质谱拥有较高的分辨率和灵敏度，对于植物这样复杂的样本尤其适合。由于植物代谢物种类十分庞大，据估计总数目在20～100万多种[14]。此外，代谢物极性相差巨大，有的初生代谢物与次生代谢物之间丰度相差超过105数量级。目前还没有一种代谢组学分析方法能完全覆盖所有的代谢物，单一的分析方法往往对不同的代谢物形成歧视效应。多个分析平台整合技术是目前单一分析技术的一种补充，达到对不同极性代谢物广谱分析。Dai等利用NMR和LCDADMS 分析3种不同栽培品种丹参Salvia miltiorrhiza Bunge cv. Sativa （SA）， cv. Foliolum （SF） 和 cv. Silcestris （SI）的代谢谱，既能检测到丹参中的28个初生代谢产物，包括碳水化合物、氨基酸、胆碱、TCA循环和，又能发现丹参中的次生代谢产物，如莽草酸途径的丹参酚酸和重要的萜类成分[15] 。

拟靶向代谢组学分析，根据研究目的的不同，代谢组学研究策略分为非靶向代谢组学（nontargeted metabolomics）和靶向代谢组学（targeted metabolomics）。非靶向代谢组学也称为发现代谢组学，预先不知道哪些代谢物会发生变化，通过比较2组样本找出差异物质，尤其适合代谢标识物发现相关研究。其特点是分析通量高、覆盖代谢物广，但是数据稳定性、重复性及定量线性范围不如靶向代谢组学分析。靶向代谢组学特定针对一定数量的目的代谢物进行分析，方法精度高、测量准确，但是测定的代谢物范围有限，依赖对照品。拟靶向的代谢组学分析方法是最近开发出来的一种方法，它结合非靶向代谢组学和靶向代谢组学的优点。方法首先筛选非靶向代谢组学所能检测到的所有峰信号，然后不依赖对照品建立这些峰的靶向分析方法。拟靶向代谢组学方法兼顾方法的精度和广度。此外，拟靶向代谢组学分析可以克服非靶向代谢组学中多样本质谱峰提取、对齐等难点。目前建立了多种拟靶向代谢组学方法如拟靶向代谢组学（pseudotargeted metabolomics）分析方法[16]、广泛靶向代谢组学（widely targeted metabolomics）方法[1718]，这些方法在筛选靶向物质时，筛选方法虽然有所不同，但目的是一致的。

消除质谱假阳性研究策略。随着高灵敏度、高分辨率色谱质谱分析仪器的迅速发展，代谢组学分析可轻松地检测数千种信号。与此同时也会不可避免地产生大量假阳性信号。这些信号包括生物来源和非生物来源两类。此外，即使对于生物来源的质谱信号，它们的峰面积是否与代谢物浓度之间存在较好的定量关系？在缺少有效的数据评价方法下，往往不容易筛选出真实的代谢标识物，或者筛选到假阳性代谢标识物。笔者采用混合所有生物样本的质控样本（quality control， QC）作为代谢物混合池，对QC进行逐级稀释，结合溶剂空白，提出5步峰过滤规则，区分假阳性质谱信号和评价每一个峰的定量能力（quantitative performance）。同时引入相对浓度指数（relative concentration index， RCI），结合QC梯度稀释曲线，建立所有质谱峰的定量校正模型。该模型不仅可以用于定量校正，而且可以将质谱峰面积归一化到RCI。该方法可以消除对照品组成的人工样本中92.4%的假阳性，消除生物样本中71.4%的假阳性质谱峰信号[19]。

质谱成像代谢组学分析技术，采用成像方式的离子扫描技术，原位分析代谢物在不同时间和空间的变化。可同时对多种分子进行原位可视化分析，从而将代谢物与组织形态学高度关联[20]。传统的代谢组学分析通常只能在均一化的样品或提取物中进行，但是，植物的各种细胞分化后具有不同的功能，特定的细胞和组织具有不同的代谢物特征。如丹参酮二萜合成基因CPS1和KSL1在丹参根木栓层中特异表达，木栓层中特异积累红色丹参酮类物质[21]。Kotaro Yamamoto等[22]通过整合质谱成像技术和单细胞质谱代谢组学技术，研究长春花茎的纵切面的质谱成像图，解析萜类生物碱合成的细胞特异性。单萜成分如马钱子苷和次番木鳖苷定位在表皮细胞中，该结果和前人报道的一致。以前报道RNA原位杂交显示大多数萜类生物碱在表皮细胞中合成，然而质谱成像结果显示多种萜类生物碱，如ajmalicine和serpentine，并没有在表皮细胞中积累，而是在异型细胞和乳管细胞中积累。质谱成像还发现了一个离子m/z 337.19也同萜类生物碱共定位在表皮细胞、异型细胞和乳管细胞中，推测它可能为长春碱类化合物或中间代谢物。作者还采用代谢组学数据手段，比较4种组织细胞中的代谢物谱的差异，在主成分分析（PCA）模型中可以区分这4种不同类型的组织细胞，而且可以发现不同组织细胞中的差异代谢物。作者还通过单细胞质谱分析，定量比较了4种组织细胞中萜类生物碱的含量和分布，PCA分析结果与质谱成像结果相似，异型细胞和乳管细胞积累相似的化合物，而与表皮细胞和薄壁细胞中积累的代谢物有所不同。

2 药用植物鉴别和质量控制的代谢组学研究

我国药材种类繁多，资源丰富，然而来源复杂，品种混淆厉害。仅《中国药典》2000 年版收载的534种中药材，即有143 种中药为多基原（二基原以上）。中药材基原品种的真伪、正宗与否，关系到该味中药的确切疗效和疗效的重现性，进而直接影响到中药制剂的质量。即使是同种药材，由于自然条件的不同，药材产量和质量也不相同，临床疗效也有相当大的差异，由此产生了“道地药材”。同时，野生与栽培药材以及不同生长年限的药材也都表现出了质和量上的差异。DNA分子标记技术，如RAPD，RFLP，很好地用于遗传多样性研究以及正品与伪品等种以上分类单元的鉴定。同时，由于DNA分子标记不受生物体发育阶段的影响，无法鉴别不同生长年限的药材，对同基原（基因型）的野生与栽培药材的鉴别也存在一定困难。植物代谢组学主要是对特定条件下代谢表型（metabolic phenotypes 或 metabotypes）以及这些表型与基因型之间联系的研究。植物次生代谢过程及代谢物的积累受到自身和环境中各种生物和非生物因素的调控，通过代谢组学研究不仅能够深入理解植物与环境的相互作用，了解植物自身基因的功能，植物代谢网络与代谢调控，还能揭示植物表型与植物生长、发育及生物多样性之间的关系。笔者将DNA分子标记技术及代谢组学技术相结合，用来鉴别中药材蒙古黄芪和膜荚黄芪。这2种黄芪植物形态非常相似，仅存在荚果有毛无毛的细微差别，它们的分类学地位仍然存在一些争议。DNA分子标记AFLP技术显示蒙古黄芪和甘肃的膜荚黄芪聚在一起，说明蒙古黄芪与甘肃的膜荚黄芪亲缘关系较近，结果支持蒙古黄芪是膜荚黄芪变种这一分类结果。而GCTOFMS代谢组学分析可以区分这2种黄芪，显示2种黄芪的代谢组存在一定的差别。通过主成分分析，找到2个品种，不同生长年限和地域差别的差异代谢物，这些代谢物可能与黄芪的生境相关[23] 。刘悦等[24]将代谢组学技术与DNA barcoding技术相结合，区分3种不同的沙棘，江孜沙棘Hippopahe gyantsensis Rousi、肋果沙棘H. neurocarpa S. W. Liu & T. N. He和西藏沙棘H. tibetana Schlechtendal。甘草为常用大宗药材，药食兼用品种，年需要量约6万吨左右。美国NIH中心的Slmmler等[25]采用基于DNA barcoding和代谢组学的方式，对甘草中3个种及其他种的变种共51个商业获得的样本进行了分析。代谢组学分析采用1HNMR和LCMS结合的手段进行，所得数据采用非监督方式主成分分析（PCA）和监督性分析典型判别分析（CDA）。结果显示，结合DNA barcoding和代谢组学技术，除了能明显区分出甘草、胀果甘草、光果甘草3个种，还能区分出不同的杂种及不同种的混合物。《中国药典》规定柴胡有2个来源：柴胡Bupleurum chinense DC. 或狭叶柴胡B. scorzonerifolium Willd.的干燥根。按性状不同，分别习称“北柴胡”和“南柴胡”，其中“南柴胡”又称红柴胡。无数学者采用色谱含量测定或者色谱指纹的方法区分二者，但均未能明显区分。秦雪梅教授和荷兰莱顿大学Verpoorte教授小组[26]，采用基于核磁的代谢组学方法将2个种明显分开，找到了区分2个种的化学标志物。“北柴胡”含有高含量的柴胡皂苷a及其类似物，而“南柴胡”含有高含量的挥发油、柴胡皂苷b1及其相同骨架的皂苷。该结果体现了核磁技术在化合物结构辨识方面和中药品种鉴定方面的独特优势。

3 代谢组学与药用植物代谢途径研究

生物合成途径是药用植物次生代谢研究的核心内容，相对初生代谢，次生代谢在植物进化过程中呈现出代谢多样性的特点，在植物类群中特异性分布。植物次生代谢一般通过关键的环化酶或合酶形成基本骨架，如萜类环化酶形成二萜、三萜的基本骨架，然后通过各种修饰酶，如P450氧化还原酶、UGT糖基转移酶、OMT甲基转移酶、卤化酶等，增加基本骨架结构的极性，引入杂原子等活性基团，使得终端产物呈现出结构多样性的特点。由于极性的增加，使得终端产物可以积累在植物细胞中[27]。丹参酮是丹参中具有活血化瘀的重要药效物质，丹参酮属于不饱和的二萜类天然产物。高伟等首次克隆并功能鉴定了丹参酮生物合成途径中2个丹参酮特有的二萜关键环化酶SmCPS和SmKSL，通过RNA干扰的方法抑制了SmCPS的表达，导致丹参酮类成分在丹参毛状根中明显下降。不同于裸子植物，被子植物丹参酮二萜合酶为单功能酶，需要SmCPS和SmKSL协作催化GGPP到丹参酮二烯[28]。崔光红等对丹参基因组序列中的7个二萜合酶基因进行系统的功能鉴定，综合利用基因表达谱、RNAi干扰，阐明SmCPS1控制着根部丹参酮类化合物的生物合成。通过代谢组学技术（LCMS和GCMS）对比转基因RNAi干扰植株与野生型植株的代谢谱，通过主成分分析能够非常清楚地区分这2组植株。LCMS代谢组学分析发现40个差异代谢物，通过比对自建的丹参次生代谢物数据库、精确相对分子质量匹配、MS/MS分析、对照品比较，鉴定其中20个差异代谢物。从GCMS得到28个差异化合物，在NIST数据库检索，相似度在800 以上的有12个，对照品比对鉴定其中8个。结果显示SmCPS1受到抑制后积累的大量二萜化合物底物，鉴定的20个代谢物均为典型的松香烷型丹参酮类结构，另外3个为重排的松香烷型结构，分别为przewalskin和salvisyrianone，以及二聚体neoprzewaquinone。通过代谢组学和RNAi干扰技术，发现丹参酮类化合物的生物合成途径并非简单的直线型模式，而是形成复杂的网络结构；通过RNAi干扰还发现大量未知的二萜类化合物[21，29]。

随着首个药用植物——丹参基因组框架图的完成[30]，将进一步推动丹参成为模式药用植物，也为系统揭示丹参次生代谢奠定坚实基础。目前，在多数植物无法进行全基因组序列测定的情况下，转录组研究已经成为分离和克隆新基因及基因功能研究的重要手段之一[31]。Gao Wei 等使用UPLCDADQTOFMS非靶向代谢组学技术分析银离子诱导的丹参毛状根，鉴定了5个明显差异的丹参酮类代谢物。转录组分析鉴定了6 358个差异基因，通过分析明显上调的富集基因，预测了70个候选的转录因子和8个P450氧化还原酶，它们可能与银离子诱导的丹参酮类物质合成相关[32]。

传统分子生物学手段克隆、验证代谢功能基因，是一份具有挑战的工作。基于联锁关联分析的代谢组学分析成为大规模、高效定位代谢物合成基因的新手段。在植物学研究领域，全基因组关联分析（genomewide association studies， GWAS）是在全基因组范围内筛选不同遗传差异个体分子标记的基础上，分析表型相关联的分子标记位点。GWAS广泛用于人类疾病与植物复杂农艺性质遗传基础的解析。GWAS结合代谢组学技术（metabolic GWAS， mGWAS）则用以解析代谢物合成的遗传机制，即代谢合成及调控的基因位点。Chen 等对524份自然栽培水稻品种资源（含有642.877万的SNPs分子标记）进行LCMS代谢组学分析，得到840多种代谢物，并检测到2 947个主效SNPs，共634个遗传位点。通过遗传和生化分析鉴定了其中5个黄酮合成的候选基因[3334]。黄瓜中的苦味物质是一类称为葫芦素，高度氧化的三萜衍生物，葫芦素类三萜普遍存在葫芦科植物中，作为抗癌药物使用。尚轶等通过GWAS分析115份黄瓜种子资源，发现了与黄瓜叶片苦味紧密连锁的SNP位点，通过体外酵母表达鉴定了黄瓜中苦味物质葫芦素C合成的关键三萜环化酶。通过共表达分析，鉴定了一个存在黄瓜基因组中的基因簇（gene cluster）。组合表达三萜环化酶和下游的P450氧化还原酶，通过靶向代谢组学分析，最终鉴定了2个P450和1个酰基转移酶的生化功能。此外，还解析了2个分别在叶和瓜里面特异调控葫芦素C合成的转录因子[35]。

4 代谢组学与药用植物代谢工程和合成生物学研究

目前药用植物鉴定的代谢途径还不是很多，代谢网络的研究鲜有报道。同位素标记方法结合代谢组学分析，可以较好地研究次生代谢网络。如添加稳定同位素13C标记的甲羟戊酸（萜类合成前提）到植物，通过非靶向代谢组学手段比较同位素标记的植株与野生型植株，可以研究植物萜类的代谢途径和网络。药用植物代谢工程主要通过基因工程的手段将代谢途径中的关限速酶、代谢途径转移到工程化的酵母或植物细胞系，调节代谢的流向，针对性地提高目标代谢物的含量。抗癌药物紫杉醇的代谢工程研究较多，Ajikumar等首先优化大肠杆菌上游途径IPP的生物合成，提高大肠杆菌IPP合成的8个步骤中的4个限速酶的表达量，使得大肠杆菌大量生成IPP。之后将植物中紫杉醇合成途径中的GGPP合成酶和紫衫二烯（taxadiene）合酶导入到前面构建的工程菌中，优化催化酶的密码子和表达水平，使得大肠杆菌中产生1 g·L-1的紫衫二烯，产量是没有经过优化菌株的1 500多倍[36]。药用植物合成生物学研究跨越了物种各自进化的代谢途径，通过挖掘代谢物合成的各种生物元件，通过人工组合、设计，产生非天然的产物或新的代谢途径，再导入底盘细胞规模化生产目的产物[37]。无论是代谢途径解析、代谢工程研究或者合成生物的研究，代谢物分析，代谢组学分析都是必不可少的研究工具。

5 药用植物分子育种与抗逆代谢组学研究

我国野生药用植物种质资源丰富，但是由于常年栽种和消耗使得许多药用植物品质出现下降，好的资源濒于枯竭。传统育种一般通过植物种内的有性杂交进行农艺性状或品质的转移与改良，如提高药用植物的抗性，提高药用植物有效成分的含量，提高产量等，这类方式存在育种周期长、遗传改良实践效率偏低的缺陷。分子育种技术通过利用控制目标性状的功能基因和调控元件，可以有效提高目标性状改良的效率和准确性，实现了由表型选择到基因型选择的过渡[38]。作物分子育种研究较为深入，Wen Weiwei通过mGWAS方法，分析了种植在多个区域702个玉米品种的983个代谢物，定位了1 459个代谢物遗传控制位点。通过突变和转基因分析进一步验证了其中的2个代谢基因，为分子育种提供了目标[39]。代谢组学还广泛应用于植物抗逆、抗病的代谢机制研究[40]。唐惠儒小组[41]采用代谢组学研究了水分流失导致的逆境胁迫对丹参根中代谢产物的影响，以冷冻干燥为参照，比较了晒干和阴干2种干燥方法的影响。结果显示水胁迫导致了丹参中代谢物轮廓发生显著的变化，晒干和阴干均显著提高了丹参酮含量，阴干提高了莽草酸途径中酚酸类成分的含量，而晒干降低了该类成分的含量。CarmoSilva等[42]采用1HNMR和GCMS代谢组学方法，比较了干旱胁迫和正常水分条件下生长的狗牙根Cynodon dactylon L.Pers.的化学物质群，验证了氨基酸在干旱胁迫下发生累积外，还新发现了一种特殊的非蛋白质氨基酸在干旱胁迫条件下特异地累积。总之，代谢组学作为一种手段可以广泛地应用于药用植物研究的方方面面。

6 问题与展望

代谢组学是从整体上分析所有小分子化合物的一门技术，在中医药各个领域有着广泛的应用。药用植物蕴含着结构丰富，有应用价值的天然产物，同时也意味着药用植物拥有许多独特的代谢基因，从基因资源和代谢多样性角度上讲，要比模式植物拟南芥和水稻更有研究价值。随着合成生物学的兴起，将会有更多的机会挖掘和利用药用植物。无论是药用植物的鉴别，质量控制，代谢途径解析，代谢工程和合成生物学研究，都离不开代谢物分析和代谢组学分析。然而代谢物的含量受到诸多因素的影响，包括遗传、环境、存储、制备、分析等各个环节的影响。同时，中医、中药是极其复杂的体系，很难单独通过某一种技术，一个实验来说清楚，犹如盲人摸象，未来需要从更多层面上系统地解析中医药中的各种问题。比较模式生物，中医药代谢组学研究还缺乏基因组信息，缺少合适的遗传材料、人工群体、自然群体等。随着技术的发展和进步，代谢组学必将朝着更加精细化的方向发展，代谢物的定量、定性分析将更加准确，各种原位分析，单细胞分析技术将更加成熟。

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