天然产物生物合成途径解析策略

邹丽秋　匡雪君　孙超　陈士林

[摘要] 天然产物合成途径解析既是本草基因组学研究的主要目标，也是天然产物合成生物学研究的重要基石。该文综述了近期相关领域的研究进展，提出了天然合成生物合成途径解析的一般策略：即首先通过同位素示踪实验结果和化学反应原理、已分离鉴定的中间产物等信息推测出可能的生物合成途径；然后利用共表达分析和/或基因簇发掘筛选出途径中的候选基因；最后对所有候选基因进行异源表达和酶活性检测确定参与代谢途径的酶，并可在原物种中进行该酶基因的抑制或过表达研究，进一步确认该酶在原物种体内的功能。天然产物生物合成途径的解析将有助于通过合成生物学技术为新药研发提供新的化合物来源，并可为中草药的分子育种研究提供“功能性分子标记”，加速优良品种的选育，推动中药农业的发展。

[关键词] 天然产物； 合成途径； 合成生物学； 分子育种

Strategies of elucidation of biosynthetic pathways of natural products

ZOU Liqiu1， KUANG Xuejun1， SUN Chao1*， CHEN Shilin2*

（1.Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking

Union Medical College， Beijing 100193， China；

2. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] Elucidation of the biosynthetic pathways of natural products is not only the major goal of herb genomics， but also the solid foundation of synthetic biology of natural products. Here， this paper reviewed recent advance in this field and put forward strategies to elucidate the biosynthetic pathway of natural products. Firstly， a proposed biosynthetic pathway should be set up based on wellknown knowledge about chemical reactions and information on the identified compounds， as well as studies with isotope tracer. Secondly， candidate genes possibly involved in the biosynthetic pathway were screened out by coexpression analysis and/or gene cluster mining. Lastly， all the candidate genes were heterologously expressed in the host and then the enzyme involved in the biosynthetic pathway was characterized by activity assay. Sometimes， the function of the enzyme in the original plant could be further studied by RNAi or VIGS technology. Understanding the biosynthetic pathways of natural products will contribute to supply of new leading compounds by synthetic biology and provide "functional marker" for herbal molecular breeding， thus but boosting the development of traditional Chinese medicine agriculture.

[Key words] natural products； biosynthetic pathway； synthetic biology； molecular breeding

doi：10.4268/cjcmm20162206

天然产物是药物研发的重要源泉，目前1/3以上的临床用药来源于天然产物及其衍生物，其中包括青蒿素、紫杉醇、长春碱和喜树碱等重要药物[1]。天然产物生物合成途径解析，既是本草基因组学研究的主要目标，也是天然产物合成生物学研究的重要基石。虽然天然产物种类繁多，结构复杂，但是它们都是由乙酸、氨基酸、莽草酸等少数前体物质通过几条主要的上游次生代谢途径合成的[2]。目前研究得比较清楚的途径包括：甲羟戊酸途径（mevalonate pathway，MVA）、磷酸甲基赤藓糖醇途径（MEP）、莽草酸途径（shinimate pathway）和丙二酸途径（malonic acid pathway）等（图1）。MVA和MEP途径都可以生成萜类的结构单元异戊二烯，前者发生在胞质中，后者发生在质体中。莽草酸途径以莽草酸为起始经过多步酶促反应主要生成芳香族化合物。丙二酸途径的主要次生代谢产物为脂肪酸、多酮、苯丙烷类等化合物。在生物体内这些代谢途径不是孤立存在的，不同次生代谢途径间会有交叉，形成代谢网络，例如，在拟南芥和金鱼草等植物中发现，MVA和MEP途径中的异戊烯焦磷酸（IPP）可以在胞质和质体间转运参与不同的代谢途径[34]。此外，一些结构复杂的化合物的生物合成可能需要不同代谢途径的参与，例如长春碱生物合成的2个中间体环烯醚萜和色胺，分别来自MVA途径和莽草酸途径。

鉴于大多数天然产物都具有共同的上游代谢途径，并且已研究得比较透彻，因此，对于某个或某类特定天然产物生物合成途径的解析通常是指对其下游特异性分支代谢途径的解析。天然产物生物合成途径解析的一般策略是：首先根据化学反应原理和已分离鉴定的中间产物推测出可能的生物合成途径，必要时可通过同位素示踪对推测途径进行进一步的确认；然后通过转录组分析获得相关基因的共表达信息，或通过基因组扫描发掘次生代谢相关的基因簇，从而发现并缩小候选基因的范围；最后对所有候选基因进行异源表达和酶活性检测确定酶的催化功能，对于遗传转化体系成熟的物种，可在原物种中进行酶基因的抑制或过表达研究，进一步确认该酶在原物种体内的功能（图2）。通过对途经中所有酶的发掘和功能确认，最终达到途径解析的目的。

1 代谢途径推测

根据已有的知识推测出一个可能的代谢途径是天然产物生物合成途径解析的第一步。化学反应原理和机制，已分离得到中间产物的化学结构等都可以为合成途径推测提供有用的线索。同位素示踪法常被用于对途径进行进一步的确认和校正。同位素标记的化合物与非标记化合物具有相同的生物学和化学性质，但是具有不同的质量，可以通过质谱仪和核磁共振仪等质量分析仪器来区分它们。因此，饲喂同位素标记的前体物质后，检测到的那些被同位素新标记的化合物被认为是代谢途径的中间产物或终产物。

Peng Di等[5]将13C标记的苯丙氨酸作为底物加入丹参毛状根培养体系中，利用UPLC/QTOF技术检测到111种同位素标记的化合物，经过与数据库比对发现8个化合物与丹参酚酸的生物合成相关。通过比较这8个含同位素化合物出现的先后顺序，推测出丹参酚酸的合成途径，并鉴定出第1个参与丹参酚酸生物合成的细胞色素P450（CYP98A14）。为了研究丹参酮合成途径，Guo等[6]通过在大肠杆菌中共表达SmKSL，SmCPS和GGPPS基因，并通过在培养基中添加13C标记的葡萄糖获得同位素标记的次丹参酮二烯，当用13C标记的次丹参酮二烯饲喂丹参毛状根后，发现其中有13C标记的隐丹参酮和铁锈醇合成，从而证明了次丹参酮二烯和铁锈醇是丹参酮合成途径的中间产物，这为后续丹参酮合成途径的解析奠定了重要基础。

2 候选基因筛选

高通量测序技术的快速发展，使得快速廉价获得一个物种的基因信息成为可能。但是从数万个基因中筛选出可能参与特定天然产物生物合成的候选基因依然是一项非常具有挑战性的工作。目前基于转录组测序的共表达分析和基于基因组测序的基因簇发掘是筛选候选基因的2个主要方法。

2.1 共表达分析 同一个天然产物生物合成途径中的基因往往是共表达的，即受到体外或体内信号刺激后，同一个途径的基因表达会同时上调或下调。基因共表达是生物对信号刺激最经济的应答方式，是生物长期进化和自然选择的结果。利用共表达分析可以对参与某个特定途径的基因进行筛选，缩小候选基因的范围。基于高通量的转录组测序分析不但可以获得生物样本在某个时刻的所有表达基因的信息，而且可以通过多个样本之间基因表达的关联分析获得基因共表达信息[711]。

Karel等[12]对过表达转录因子ORCA2或ORCA3的长春花悬浮细胞转录组进行研究，发现有3个氧化还原酶、4个细胞色素P450和1个糖基转移酶与基因GES/G8O有显著的共表达趋势，已知GES/G8O基因是长春花环烯醚萜途径中的酶，该途径是萜类吲哚生物碱合成途径的重要组成部分。经过进一步的功能验证鉴定出4个酶参与了环烯醚萜途径，分别是8羟基香叶醇氧化还原酶、环烯醚萜氧化酶、7脱氧马钱苷酸糖基转移酶和7脱氧马钱苷酸羟化酶，至此长春花环烯醚萜途径中所有的酶都已被鉴定，从而为利用合成生物学手段生产有药理活性的环烯醚萜及生物碱奠定了坚实的基础。Guo等[6]通过对银离子诱导的丹参毛状根转录组进行测序和分析，发现有6个细胞色素P450基因与已鉴定的合成丹参酮骨架的2个酶SmCPS和SmKSL共表达，经功能验证发现其中一个细胞色素P450（CYP76AH1）能对次丹参酮二烯进行羟基化生成铁锈醇。

2.2 基因簇发掘 在放线菌和真菌中，同一代谢途径中的酶基因往往在基因组中是成簇存在的。近年来发现在高等植物中，某些代谢途径中的酶基因也可以形成基因簇，这使得通过基因组序列测定寻找代谢途径候选基因成为可能。对于基因组较小的物种，全基因组测序和组装是发现基因簇的有效方法。但是对于基因组较大或遗传背景不清晰的药用植物，通过构建BAC文库，利用途径中已知基因为靶点，筛选可能含基因簇的BAC并进行测序是一种经济可行的快速获得基因簇的方式。当然，根据已有的知识，多数植物次生代谢途径的基因并不形成基因簇。因此基因簇发掘的方法在植物天然产物合成途径候选基因筛选中具有较大的局限性。

诺斯卡品是一种来源于罂粟的具有抗癌活性的生物碱。Thilo Winzer等[13]对含诺斯卡品的HN1和不含诺斯卡品的HM1和HT1 3个罂粟品种进行转录组分析，发现有10个基因仅在品种HN1中表达。用HM1与HN1进行杂交产生271株F2代，对F2代进行基因型及诺斯卡品含量分析，发现与HN1相关的特异基因与诺斯卡品的含量呈一定相关性，因此推测参与诺斯卡品生物合成的基因呈基因簇分布。为了验证推测，构建了HN1的BAC文库，筛选出含10个特异基因的6个BAC克隆，通过对这些BAC克隆进行测序和组装得到一个401 kb的基因簇。通过对这10个基因的功能验证解析出诺斯卡品的生物合成途径。Andrew J King等[14]通过对蓖麻的基因组数据分析，发现有8个细胞色素P450、2个乙醇脱氢酶、1个BAHD乙酰转移酶与蓖麻烯和五针松素合成酶位于同一个基因簇上，通过在烟草中共表达蓖麻烯合成酶与发掘出的P450， 发现其中3个P450（CYP726A14，CYP726A17，CYP726A18）能催化蓖麻烯生成5羟基蓖麻烯或者5酮基蓖麻烯。

3 候选基因功能验证

通过基因共表达分析和基因簇发掘可以有效缩小候选基因的范围，减少候选基因功能验证的工作量。由于天然产物的结构千差万别导致其合成途径中的酶具有丰富的多样性，因此针对每一个酶的功能验证实验都具有一定的独特性。候选基因的功能验证需要综合运用分子生物学和分析化学等实验技术，是天然产物合成途径解析中最关键也是最具有挑战性的一步。

3.1 异源表达及酶活性检测 将候选基因在异源表达系统中进行表达，成功表达的酶蛋白可以催化内源性或外源性底物生成产物，通过LCMS或GCMS等技术对产物进行分析鉴定，从而确定酶的催化活性[1518]。目前常用于候选基因功能验证的异源表达系统包括大肠杆菌、酵母、拟南芥和烟草等。

由于具有遗传背景清晰、培养周期短、操作技术简单等特点，使得大肠杆菌成为应用最广泛的原核表达系统[1923]，一些天然产物合成相关的酶可以成功地在大肠杆菌中进行表达和鉴定，例如紫杉醇侧链的酰基转移酶。紫杉醇属于二萜类化合物，是销量最大的抗肿瘤天然药物。紫杉醇除了含有一个三环紫杉烷的核心结构外，还具有由酰氧基组成的侧链，而酰基转移酶是紫杉醇侧链形成的重要酶类。Walker等[24]从红豆杉cDNA文库中筛选出了9个可能参与紫杉醇生物合成的酰基转移酶并在大肠杆菌中进行表达，发现只有TAX10能将底物Ndebenzoyl（3′RS）2′deoxytaxol转化为2′deoxytaxol，表明该基因编码紫衫烷C13侧链N苯甲酰转移酶，是参与紫杉醇最后一步酰基化的酰基转移酶。

酿酒酵母是应用最广泛的真核表达系统，对于一些在大肠杆菌中无法成功表达的酶基因，可以尝试在酿酒酵母系统中进行表达。细胞色素P450由于是膜蛋白，很难在大肠杆菌中表达，因此酿酒酵母常常是细胞色素P450表达的首选系统[2529]。目前的抗疟疾一线药物青蒿素是倍半萜类化合物， 2006年Teoh等[30]从黄花蒿腺毛的cDNA文库中筛选出一个细胞色素P450基因（CYP71AV1），并在酿酒酵母中进行了表达，发现该P450能催化三步连续的反应，使底物紫穗槐4，11二烯经过青蒿醇，青蒿醛生成青蒿酸。

由于具有成熟高效的遗传转化体系，一些模式植物，如拟南芥、烟草等也常被用于途径基因的异源表达和鉴定[31]。与原核生物大肠杆菌和低等真核生物酿酒酵母相比，这些模式植物在次生代谢合成途径和蛋白的翻译后修饰上与候选基因的来源植物具有更多的相似性，因此在植物蛋白的异源表达上具有一定的优势。例如，呋喃香豆素为苯丙烷类分子，其在保护植物免受虫害方面具有重要作用。Fazeelat等[32]在产呋喃香豆素的芸香中克隆到了1个CYP98A家族的CYP98A22。为了鉴定CYP98A22的功能，他们在酿酒酵母中进行异源表达但没有成功。随后利用农杆菌介导的方法将CYP98A22基因导入烟草，成功表达出CYP98A22蛋白。通过加入不同的测试底物，发现CYP98A22对底物βcoumaroylquinate的亲和性最高。

3.2 基因表达抑制 可以通过基因删除或基因表达抑制全部或部分缺失酶的功能，然后检测植物体内各种次生代谢产物含量的变化，来进一步验证酶在原植物体内的生物活性。通常酶的功能缺失会导致上游底物的积累和下游产物的减少。用于基因功能缺失的方法较多，目前最常用是RNA干扰（RNAi）和病毒诱导的基因沉默技术（virusinduced gene silencing，VIGS）。RNAi和VIGS均属于转录后基因沉默（posttranscription gene silencing， PTGS）。

RNAi 是一种序列特异性的PTGS过程，通过双链RNA引起具有相同序列的mRNA发生降解来抑制基因的表达[33]。在罗勒中丁香酚和木质素享有共同的初始合成步骤，均在4香豆酸CoA连接酶（4CLs）的作用下将羟基肉桂酸转化为它们的共同前提物质，4CLs被认为是从苯丙烷代谢到木质素、黄酮类化合物等几大生物代谢的一个分支点[3435]。为了弄清丁香酚起始步骤的代谢流，Shubhra Rastogi等[36]克隆了圣罗勒Ocimum sanctum的Os4CL基因。利用RNAi技术短暂抑制基因Os4CL的表达，通过定量分析发现经RNAi处理后的叶片与对照相比丁香酚含量降低了31%，5个酚酸底物除了SIN外均有增加，其中COU增加量最大，与对照相比经RNAi处理后的叶片COU增加了10倍，因此，在罗勒腺毛中高度表达的基因Os4CL通过对底物COU，FER，CAF，CIN表现出不同的催化活性使得代谢流流向丁香酚。

VIGS是利用病毒将内源基因同源序列导入植物中，通过PTGS引起靶基因沉默。近年来，关于长春花中MIA生物合成的限制性前体是萜类还是吲哚类颇有争议。Krishna等[37]采用VIGS技术说明了这个问题，Krishna等克隆了香叶醇合成酶（GES）的特异片段并构建到病毒载体pTRV，对长春花进行了VIGS验证，通过定量分析发现VIGS处理组的GES的表达量降低了80%，长春碱的含量降低了49%，文多灵降低了57%，而长春花碱则降低了60%，对VIGS处理组进行香叶醇饲喂发现MIA的含量显著增加，以上实验表明在长春花的叶中萜类是MIA生物合成的限制性前体。

3.3 基因过表达 基因过表达（overexpression）也常用于候选基因的功能验证，通过检测植物中代谢产物产量的增加来确定酶的功能。基因过表达很少单独使用，常结合RNAi实验以更全面地验证酶在原植物体内的功能。基因过表达一般可以通过增加基因的拷贝数或者采用强启动子来实现。

Wang等[38]从西洋参中克隆到了一个细胞色素P450（CYP6H）并进行了过表达和RNAi研究。RTPCR分析发现在过表达载体转化的西洋参毛状根中CYP6H表达量显著增加，同时毛状根中原人参二醇型皂苷（Rb1， Rb2， Rc， Rd）含量减少，原人参三醇型皂苷（Re，Rf， Rg1）含量增加，结合RNAi等实验结果证明在西洋参中CYP6H能对原人参二醇的6位进行羟基化，将原人参二醇转化为原人参三醇。

尽管生物合成途径解析始终是中药和天然产物研究领域的焦点，但是相关途径的解析进展非常缓慢，一些具有重大商业价值的天然药物，如紫杉醇、长春碱、喜树碱等的合成途径至今还未被完全解析。一直以来，遗传信息的匮乏和候选基因筛选手段的缺失是限制天然产物途径解析的2个主要瓶颈。随着高通量测序技术的出现和生物信息学分析方法的逐步完善，使人们看到了克服两大瓶颈的曙光。高通量测序技术导致测序成本急剧下降，使得廉价快速获得基因信息成为可能。一些重要的药用模式生物，如灵芝[3940]、丹参[41]和长春花[42]等的基因组相继绘制完成。高精度的基因组图谱可以提供准确的基因位置信息，为基因簇的发掘提供便利。而转录组测序和分析技术的进步使得在全基因组水平上进行共表达分析成为可能。随着本草基因组学研究的进一步深入，和各种组学技术的综合运用，天然产物合成途径解析研究将进入一个快速发展的“黄金时期”。天然产物生物合成途径解析将为天然产物合成生物学研究提供丰富的元件，推动该学科的发展，为天然药物的生产和研发提供新的化合物来源；同时途径解析也将为中草药的分子育种研究提供“功能性分子标记”，加速优良品种的选育，推动中药农业的发展[43]。

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[责任编辑 孔晶晶]