黄酮类化合物合成途径及合成生物学研究进展

邹丽秋　王彩霞　匡雪君　李滢　孙超

[摘要] 黄酮类化合物是来源于植物的一类重要的次生代谢产物，具有抗癌、抗氧化、抗炎、降低血管脆性等多种药理作用。黄酮类化合物的主要合成途径已经研究得比较清晰，即首先合成二氢黄酮类的柚皮素或松属素，然后进一步通过分支途径合成黄酮、异黄酮、黄酮醇、黄烷醇和花色素等。黄酮生物合成途径的解析为其合成生物学研究奠定了基础。利用合成生物学技术已成功在大肠杆菌或酵母中合成了黄酮类化合物，如柚皮素、松属素和非瑟酮等。合成生物学研究为黄酮类化合物提供了新的来源，将进一步推动黄酮类药物和保健品的研发，使其在人类饮食和健康等领域发挥更大的作用。

[关键词] 黄酮类化合物； 合成途径； 合成生物学

Advance in flavonoids biosynthetic pathway and synthetic biology

ZOU Liqiu1， WANG Caixia2， KUANG Xuejun1， LI Ying1， SUN Chao1*

（1.Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking

Union Medical College， Beijing 100193， China；

2.Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] Flavonoids are the valuable components in medicinal plants， which possess a variety of pharmacological activities， including antitumor， antioxidant and antiinflammatory activities. There is an unambiguous understanding about flavonoids biosynthetic pathway， that is，2Sflavanones including naringenin and pinocembrin are the skeleton of other flavonoids and they can transform to other flavonoids through branched metabolic pathway. Elucidation of the flavonoids biosynthetic pathway lays a solid foundation for their synthetic biology. A few flavonoids have been produced in Escherichia coli or yeast with synthetic biological technologies， such as naringenin， pinocembrin and fisetin. Synthetic biology will provide a new way to get valuable flavonoids and promote the research and development of flavonoid drugs and health products， making flavonoids play more important roles in human diet and health.

[Key words] flavonoids； biosynthetic pathway； synthetic biology

doi：10.4268/cjcmm20162207

黄酮类化合物（flavonoids）是植物特有的次生代谢产物，指2个苯环（A与B环）通过中央3个碳原子相互连接形成具有C6C3C6基本结构的一系列化合物[1]，由于这类化合物大多呈黄色或淡黄色，因此称为黄酮。目前已知的黄酮类化合物超过1万种，根据结构的不同可以分为二氢黄酮（2Hflavanones）、黄酮（flavones）、异黄酮（isoflavones）、黄酮醇（flavonols）、黄烷醇（flavanols）和花色素六大类（anthoyanidins）[2]。黄酮类化合物是多种药用植物的主要有效成分，例如，黄芩中的黄芩苷和黄芩素为黄酮及黄酮醇类化合物，甘草中的甘草素和橙皮中的橙皮素为二氢黄酮类化合物，儿茶中的儿茶素为黄烷酮类化合物，葛根中的葛根素为异黄酮类化合物。在植物中黄酮大多与糖结合，以黄酮苷的形式存在，少部分以游离态存在。现代药理学研究表明黄酮类化合物具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤等多种药理活性，在药品开发和食品保健领域具有广泛的应用前景[34]。

1 黄酮类化合物的合成途径

黄酮类化合物的生物合成首先通过苯丙烷途径将苯丙氨酸转化为香豆酰CoA，香豆酰CoA再进入黄酮合成途径与3分子丙二酰CoA结合生成查尔酮，然后经过分子内的环化反应生成二氢黄酮类化合物[5]。二氢黄酮是其他黄酮类化合物的主要前体物质，通过不同的分支合成途径，可以分别生成黄酮、异黄酮、黄酮醇、黄烷醇和花色素等（图1）。

1.1 酚酰CoA的形成 酚酰CoA包括香豆酰CoA和肉桂酰CoA，是黄酮类化合物生物合成的起始物质。L苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（PAL）的作用下能生成反式肉桂酸，反式肉桂酸然后在肉桂酸4羟化酶（C4H）的作用下能转化为香豆酸，而L酪氨酸能在酪氨酸解氨酶（TAL）的作用下直接转化为香豆酸。香豆酸和肉桂酸在香豆酰CoA连接酶（4CL）的作用下分别形成相应的酚酰CoA。在大多数药用植物中参与酚酰CoA生物合成的基因已经得到鉴定。PAL是苯丙烷途径中的第1个关键酶，其能催化L苯丙氨酸非氧化性脱氨生成反式肉桂酸（cinnamic acid），Zhang等[6]从青蒿中克隆到了PAL，该基因与其他植物的PAL具有高度同源性。通过RTPCR分析表明该基因在青蒿的嫩叶中高表达，在大肠杆菌中PAL的酶活力能达287.2 U·mg-1。C4H是苯丙烷途径的第2个酶，其能对反式肉桂酸进行羟基化形成香豆酸（coumaric acid），C4H在许多植物中都已得到鉴定例如长春花[7]、黄芩[8]、三角叶杨[9]等。Kong等[10]通过分析虎眼万年青转录组数据克隆到了1个C4H基因，通过酵母异源表达分析表明该基因能将反式肉桂酸转化为香豆酸。4CL是苯丙氨酸途径中的关键性限速酶，其能催化香豆酸和肉桂酸分别形成香豆酰CoA和肉桂酰CoA。Gao等[11]从地钱中克隆到了1个4CL基因，在大肠杆菌中该基因能将香豆酸转化为对羟基香豆酰CoA，酶动力学分析表明该酶的最适底物是香豆酸。

1.2 从酚酰CoA到二氢黄酮 二氢黄酮主要包括柚皮素和松属素。查耳酮合成酶（CHS）是黄酮类化合物合成途径中的第1 个限速酶，第1 个植物中的CHS是1983 年在荷兰芹中发现的，其能将3 分子的丙二酰CoA和1 分子的香豆酰CoA或者肉桂酰CoA结合形成一个具有C13 结构的柚皮素查耳酮或松属素查耳酮。查耳酮异构酶（CHI）是黄酮类化合物代谢途径中的第2 个关键酶，第1 个CHI基因是Mehdy等[12]于1987 年从法国豌豆中分离出来的，其能使CHS的催化产物发生分子内环化。柚皮素查耳酮和松属素查耳酮在CHI的催化下能形成柚皮素和松属素。Cheng等[13]在银杏叶中克隆到了CHI基因，在大肠杆菌中该酶能将6羟基查耳酮转化为柚皮素。Park等[14]从黄芩中克隆到了CHI基因，为了验证该基因的功能，该研究小组构建了CHI基因的过表达和RNAi载体并转化毛状根。与对照组相比，CHI基因过表达的毛状根中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素含量明显增加，而在CHI基因表达通过RNAi受到抑制后，黄酮类化合物的含量明显降低。

1.3 从二氢黄酮到各类黄酮类化合物 二氢黄酮类化合物能在黄酮合酶（FNS）催化下在2，3位脱氢形成双键生成黄酮类化合物。FNS存在2种类型FNSⅠ和FNSⅡ，其中FNSⅠ主要分布于伞形科植物中，能直接将柚皮素转化为芹黄素，而FNSⅡ则于植物中普遍存在且表现出完全不同的催化活性，其能在C2和C3脱氢生成黄酮类化合物[1516]。Han等[17]从地钱中克隆到了FNS基因，通过异源表达和体外酶活分析显示，该酶具有FNSI的催化活性，能将柚皮素转化为芹黄素和2羟基柚皮素。Wu等[18]从金银花中克隆到了2个FNS基因（LjFNSⅡ1.1和LjFNSⅡ2.1），从灰毡毛忍冬中克隆到了一个FNS基因（LmFNSⅡ1.1），在酵母中表达的LjFNSⅡ1.1， LjFNSⅡ2.1和LmFNSⅡ1.1分别能将圣草酚，柚皮素，甘草素转化为木樨草素，芹黄素和7，4′二氢黄酮（DHF）。其中LjFNSⅡ1.1与LjFNSⅡ2.1表现出的不同催化活性主要是由于242位的氨基酸差异引起的，研究表明在206和381位的甲基化能显著提高LjFNSⅡ1.1的催化活性。

二氢黄酮类化合物能在异黄酮合成酶（IFS）的催化下将芳香基团从2位向3位转移生成异黄酮类化合物。Misra等[19]首次从补骨脂中克隆到了PcIFS基因，该基因在补骨脂的各个组织器官中均有表达，并可以被茉莉酸甲酯和水杨酸的诱导。为了验证该基因的功能，该研究小组在烟草中对PcIFS基因进行了过表达分析，与对照组相比过表达烟草花瓣中异黄酮含量有显著积累。Jung等[20]从大豆EST中筛选出了2个IFS基因并在拟南芥中对其进行了功能验证，在表达IFS的拟南芥中能检测到染料木黄酮，说明IFS参与异黄酮类化合物的生物合成。

二氢黄酮类化合物能在黄烷酮3羟化酶（F3H）的作用下生成二氢槲皮素和二氢山柰素等二氢黄酮醇类化合物，之后又在黄酮醇合酶（FLS）的作用下去饱和形成黄酮醇类化合物。F3H能在5，7，4黄烷酮 C3位进行羟化反应，生成二氢山柰素，而该物质则是合成黄烷酮和花色素的重要中间产物，因此F3H是控制黄酮合成与花青素苷积累的分流节点，被认为是整个类黄酮代谢途径的中枢[21]。Xiong等[22]首次从青蒿中克隆到了F3H基因，通过体外酶活分析发现F3H能将松属素转化为二氢山柰酚。黄酮醇合成酶（FLS）是黄酮类化合物合成途径与儿茶素合成途径的桥梁，二氢黄酮醇能在FLS的作用下去饱和形成黄酮醇类化合物[23]。Xu等[24]从银杏中克隆到了FLS基因，在大肠杆菌中该酶能将二氢山柰酚转化为山柰酚，同时该酶也能将柚皮素转化为山柰酚，该研究表明在黄酮类化合物合成途径中FLS是一个双功能酶。二氢黄酮醇类化合物能在二氢黄酮醇4还原酶（DFR）的作用下生成无色花色素类化合物，之后又在无色花色素还原酶（LAR）的作用下转化为儿茶酚等黄烷醇类化合物。二氢黄酮醇 4还原酶（DFR）是花青素和鞣质合成途径中的关键酶，其是一个重要的分支点[25]。Cheng等[26]从银杏中克隆到了3个DFR基因（DFR1，DFR2，DFR3），在大肠杆菌中表达的DFR1与DFR3能将二氢槲皮素转化为无色花青素，而DFR2能将二氢山柰酚转化为白天竺葵苷元。原花色素是植物应对生物及非生物胁迫的一种重要化合物，而LAR是参与原花色素生物合成的一个关键酶。Wang等[27]从三叶杨中克隆到了LAR基因（PtrLAR1）。为了验证该基因的功能，该研究小组在白杨中对基因PtrLAR1进行了过表达分析，发现过表达植株中的原花色素有明显的增加，同时儿茶素和表儿茶素也有显著的增加。

花色素合成酶（ANS）是位于花青素合成途径中的倒数第2个酶，该酶能将无色花青素转化为花青素。Xu等[28]从银杏中克隆到了ANS基因，在大肠杆菌中进行表达后，该酶能将无色花青素转化为花青素，同时该酶也能将二氢槲皮素转化为槲皮素，说明ANS在花青素和黄酮醇合成途径中是一个双功能酶。

1.4 黄酮类化合物的结构修饰 黄酮类化合物在甲基和糖基转移酶等修饰酶的催化下能形成多种黄酮类衍生物。Li等[29]首次从葛根中克隆到了一个异黄酮3O甲基转移酶（OMT）基因，通过在大肠杆菌和酵母中进行表达，发现该酶能对异黄酮的3位羟基进行甲基化。在植物的组织内多数黄酮与糖结合，以黄酮苷的形式存在，对黄酮类化合物进行糖基化修饰有利于增加产物的稳定性及溶解性。Li等[30]从葛根中分离了7个全长的糖基转移酶候选基因并在酵母表达体系中对这些基因进行了功能验证，通过分析发现有一个候选基因（PlUGT1）能将异黄酮的7位羟基进行糖基化，这些实验表明PlUGT1是一个异黄酮7O糖基转移酶。Wang等[31]从葛根中克隆到了异黄酮4′，7O二糖苷糖基转移酶（PlUGT2）基因，通过体外酶活分析发现PlUGT2能对异黄酮的O4′和O7′进行糖基化，Realtime PCR发现PlUGT2在葛根根中表达量最高，这与4′，7O二糖苷的积累模式相同。PlUGT的挖掘及鉴定将有利于更好地理解葛根中黄酮类化合物的糖基化反应。

2 黄酮类化合物的合成生物学研究

对黄酮类化合物合成途径的深入研究和解析为其合成生物学研究奠定了基础，推动了相关领域的快速发展，近年来已对槲皮苷[32]、柚皮素[33]、松属素[34]、儿茶素[35]、金雀异黄酮[36]、非瑟酮[37]和无色花青素[38]等多种黄酮类化合物开展了合成生物学相关研究。

2.1 柚皮素 Santos等[39]将来源于类球红细菌的RgTAL，有高效催化活性的Sc4CL和PhCHS及经密码子优化的MsCHI一起构建到表达载体，以产酪氨酸的大肠杆菌为底盘细胞，在含葡萄糖的MOPS培养基里生产出了柚皮素29 mg·L-1。丙二酰CoA是黄酮类化合物生物合成的重要底物之一，但因其在微生物中合成较少，使其成为黄酮类化合物合成生物学研究的一个瓶颈。在该研究中采用了2种策略来提高丙二酰CoA的供应，策略一：构建一条丙二酸盐同化途径增加丙二酰CoA的供应；策略二：添加脂肪酸途径的抑制剂浅蓝菌素用于抑制竞争支路，限制丙二酰CoA向脂肪酸转化。通过以上2个途径的改造，柚皮素的产量分别增加了59%，190%，最终使柚皮素的产量达到了84 mg·L-1。

2.2 松属素 Wu等[40]利用合成生物学手段首次将葡萄糖转化为松属素，为了实现二氢黄酮的从头合成，该研究小组在大肠杆菌中构建了4个功能模块，模块一含内源性3脱氧D阿拉伯庚酮糖酸7磷酸合酶基因aroFwt和抗反馈抑制的突变预苯酸脱水酶基因pheAfbr，可以将葡萄糖转化为苯丙氨酸；模块二含基因PAL和4CL，将苯丙氨酸转化为肉桂酰CoA；模块三含基因三叶草根瘤菌丙二酰CoA合酶matB和丙二酸盐载体蛋白matC，增加丙二酰CoA的供应；模块四含基因CHS和CHI，将肉桂酰CoA和丙二酰CoA转化为松属素；对这4个模块进行优化调节最终使得松属素的产量达到40.02 mg·L-1。Cao等[41]通过在大肠杆菌中过表达脂肪酸合成途径中的基因β酮乙基ACP 合成酶Ⅲ （FabH） 和 β酮乙基ACP 合成酶Ⅱ （FabF）使得大肠杆菌中丙二酰CoA的表达量分别增加了1.4，1.6倍，导致松属素的产量分别增加了10.6，31.8倍，该实验结果表明过表达FabF能提高丙二酰CoA和松属素的产量。随后，该研究小组在过表达FabF的菌株中加入了浅蓝菌素使松属素的产量最终由25.8 mg·L-1增加到 29.9 mg·L-1。

2.3 非瑟酮 非瑟酮存在于多种水果和蔬菜中，具有抗衰老，抗炎，抗癌和抗病毒等功效。基于非瑟酮与槲皮素相似的结构，Stahlhut等[37]推测非瑟酮可能通过一个类似于槲皮素生物合成途径进行合成，因此提出一个新颖的在大肠杆菌中以L酪氨酸为前体合成非瑟酮的生物合成途径。在该途径中酚酰CoA在CHS及CHR的催化下生成异甘草素，然后在CHI的作用下转化为甘草素，甘草素在F3H的作用下转化为garbanzol，该化合物与二羟基山柰酚具有相似的结构，最后garbanzol在黄酮单氧化酶（FMO）和细胞P450还原酶（CPR）的作用下转化为非瑟酮，该途径中以O2， NADPH， aKG作为辅助因子。这是首次利用大肠杆菌将芳香族氨基酸转化为非瑟酮。最终，在该研究中构建的工程菌株能产12.5 mg·L-1的香豆酸和0.3 mg·L-1非瑟酮。

黄酮类化合物具有多种药理活性，在人类的健康及饮食方面发挥着具有重要作用。过去大多数黄酮类化合物都是通过植物提取和化学合成获得，这会带来资源过度开采和环境污染破坏等问题。随着人们健康观念的不断提高，人们对黄酮类药品和保健品的需求量逐渐增大，现有的产量将难以满足日益增长的市场需求。随着高通量测序技术和其他组学技术在本草基因组学（herbgenomics）研究中的应用，极大地推动了黄酮类化合物合成途径研究的进展，为其合成生物学研究奠定了基础[4243]。因为柚皮素和松属素是多种黄酮类化合物的前体物质，因此对这2种化合物的合成生物学研究最为深入和广泛。早期的研究通过在大肠杆菌或者酵母中表达一些关键酶基因，可以将外源添加的香豆酸、苯丙氨酸、肉桂酸等前体物质转化为柚皮素和松属素，但是由于这些前体物质昂贵导致难以产业化。近期研究表明可以通过合成生物学方法直接以葡萄糖为底物合成柚皮素和松属素，这将极大地降低生产成本。通过进一步优化黄酮生物合成体系，提高终产物的产量，推动黄酮合成生物学研究从实验室向工业化生产的转化，从而为黄酮类药物和保健品的研发提供新的化合物来源。

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[责任编辑 孔晶晶]