低氧下Crocin联合顺铂对人胃癌BGC-823细胞增殖的影响*

骆玉霜，格日力，沈存芳，李　燕，范宝华

(1.青海大学高原医学研究中心，青海 西宁 810001；2.青海大学附属医院肿瘤内科，青海 西宁 810001)

低氧下Crocin联合顺铂对人胃癌BGC-823细胞增殖的影响*

骆玉霜1，2，格日力1△，沈存芳2，李燕2，范宝华2

(1.青海大学高原医学研究中心，青海 西宁 810001；2.青海大学附属医院肿瘤内科，青海 西宁 810001)

摘要目的探讨藏红花素联合顺铂(Crocin+DDP)低氧下对人胃癌细胞增殖的影响。方法实验分对照组、C1组、C2组、Z1组、Z2组、C1+Z1组、C1+Z2组、C2+Z1组、C2+Z2组。在低氧环境下培养人胃癌BGC-823细胞，经Crocin、DDP处理后，采用高倍显微镜观察细胞形态变化；各组药物处理胃癌BGC-823细胞后，利用MTT检测细胞增殖情况。结果1)从形态学观察，2%低氧下BGC-823细胞大量死亡，5%低氧下数量减少，MTT示：低氧下48 h BGC-823细胞OD值低于常氧下。2)低氧下DDP处理BGC-823细胞后从形态学观察：细胞固缩、细胞数量减少。MTT示：低氧条件下C1、C2抑制率(分别为30.2%、52.7%)低于在常氧下抑制率(分别为34.9%、59.4%)，P<0.01。3)从形态学观察，常氧下16 mg/mL以下Crocin作用BGC-823细胞后，细胞形态无明显改变，而在低氧下数量增多。MTT示：在低氧下Z2组OD值为0.657±0.038，与低氧对照组(OD值0.554±0.028)比较，存活的细胞增多，P<0.01。4)MTT示：5%低氧下C1+Z1组作用BGC-823细胞48 h，其抑制率为34.7%，与C1组(30.2%)比较，抑制率下降；C1+Z2组抑制率为22.3%，与C1组比较，抑制率下降，P<0.05。C2+Z1组作用BGC-823细胞48 h，抑制率(37.2%)与C2组(52.7%)比较，抑制率下降，P<0.01；C2+Z2组抑制率(51.4%)与C2组比较，抑制率下降。结论1)低氧抑制BGC-823的细胞增殖，低氧可能增加BGC-823细胞对DDP的耐药性。在低氧条件下，一定浓度的Crocin对BGC-823细胞可能起保护作用，抑制DDP对BGC-823细胞抗增殖能力。

关键词藏红花素顺铂细胞增殖低氧BGC-823细胞

项目基金*：青海省科技厅科研(2014-ZJ-737)，青海大学附属医院中青年科研 (ASRF-2014-22)

骆玉霜(1972~)，女，汉族，河南籍，主任医师.△：通迅作者，E-mail：geriligao@hotmail.com

中图分类号R735

文献标识码识码A

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.02.004

AbstractObjectiveTo investigate the effect of Crocin combining with cisplatin on the proliferation of gastric cancer BGC-823 cells under hypoxia.Methods Microscope was used to observe morphological changes of BGC-823 cells after cultured with different concentrations of crocin or cisplatin.Anti-proliferation effect was detected by MTT assay.The trial was set up control group，C1 group(0.8μg/mL DDP)，C2 group(1.6μg/mL DDP)，Z1 group(8mg/mL Crocin)，Z2 group(16 mg/mL Crocin)，C1+Z1 group，C1+Z2 group，C2+Z1 group and C2+Z2 group.Results 1)Morphologically，a large number of BGC-823 cell deaths were observed after 48 h culture in hypoxic(2% O2)condition.A reduction of the amount of cells was observed after 48 h culture in hypoxic(5% O2)condition.The OD value in hypoxia measured by MTT assay was lower than that in normoxia.2)Pyknosis and significant reduction of the amount of BGC-823 cells were observed after being treated by DDP in hypoxia.The inhibitory rates of C1 group and C2 group under hypoxia were 30.2% and 52.7% respectively，which were lower than those under normoxia(34.9%，59.4%)，P<0.01.3)Few alterations of BGC-823 cell morphology were observed after being treated by crocin with concentration below 16 mg/mL under normoxia.The OD value of BGC-823 cells treated by Z2 group was 0.657±0.038，which was higher than that of control group(0.554±0.028)under hypoxia，P<0.01.4)The inhibitory rate of C1+Z1 group was 30.2%，which was lower than that of C1 group；the inhibitory rate of C1+Z2 group was 22.3%，which was lower than that of C1 group(P<0.05)under hypoxia.The inhibitory rate of C2+Z1 group was 50.7%，which was lower than that of C2 group，P<0.01；the inhibitory rate of C2+Z1 group was 51.4%，which was lower than that of C2 group under hypoxia.Conclusions Hypoxia inhibits proliferation of BGC-823 cell and increases drug-resistance to DDP.Crocin protects BGC-823 cells from the ability of DDP on anti-proliferation and anti-apoptosis under hypoxia.

KeywordsCrocinCisplatin(DDP)Cell proliferationHypoxiaBGC-823 cell

收稿日期2015-01-06

THE EFFECT CROCIN COMBINING WITH CISPLATIN

ON PROLIFERATION OF GASTRIC CANCER BGC-823

CELLS UNDER HYPOXIA

Luo Yushuang1，2，Ge Rili1△，Shen Cunfang2，Li Yan2，Fan Baohua2

(1.Research Center for High Altitude Medicine，Qinghai University School of Medicine，Xining，810001；

2.Department of oncology，Affiliated hospital of Qinghai university，Xining 810001，China)

全身化疗是晚期胃癌患者的主要治疗措施。其中顺铂(Cisplnt，DDP)为最常用的化疗药物。到目前为止，由于耐药所致，晚期胃癌的化疗有效率仍然在50%左右。

由于多数中药具有多靶点作用的特点，作为肿瘤多药耐药逆转剂较化学逆转剂有很大的优越性。研究发现，藏红花素(Crocin)不仅可增强低氧耐受，而且对多种肿瘤细胞有抑制作用[1-5]。但Crocin在低氧环境下对肿瘤细胞抑制作用及机制不明。

我们的研究拟证实：Crocin可改善肿瘤细胞低氧环境，增加DDP抗肿瘤作用。

1材料与方法

1.1　主要药品与试剂选择

Crocin、PDD(Sigma公司)；人胃癌细胞株BGC-823(中科院细胞库)；RPMI-1640培养基(Hyclone)；胎牛血清(Gibco)；MTT粉(上海生物工程技术服务有限公司)；二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，Sigma)。

1.2　Crocin溶液的配制

将1000 mg Crocin粉末溶于20 mL PBS(0.01mol/L、pH=7.2)中，并加入62.5 mg EDTA配成贮存液，4 ℃保存。以PBS稀释至应用浓度。

1.3　细胞培养

将人胃癌BGC-382细胞放入含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640培养基，并置于细胞培养箱(37℃、5%CO2，饱和湿度)培养。每天观察细胞生长情况，2～3 d换液一次。当细胞生长达到铺满70%～80%时，以0.25%胰蛋白酶消化，通常按照1：3～1：5的比例传代，每周传代两次，当细胞传至8～10代时进行实验。细胞低氧环境培养采用美国Queue多气体细胞培养箱，N2调节孵箱内O2分压，使O2分压为2%～5%、CO2分压为5%。

1.4　高倍显微镜观察细胞形态变化

在常氧、低氧下，在BGC-823细胞中加入不同浓度的Crocin、DDP并作用48 h后，使用高倍倒置显微镜观察BGC-823细胞形态特点并拍照。

1.5　细胞增殖抑制率测定

取对数生长期的细胞以3×107/L的密度接种于96孔培养板，每孔体积为200 μL，待细胞贴壁后分别加入Crocin(浓度2、4、8、10、20mg/L)、DDP(浓度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0μg/mL)，并设阴性对照组(细胞正常生长组)，每个浓度组设5个复孔，四周加入不含药物的细胞培养液作空白对照。培养48 h后，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μL，继续培养4 h，轻轻吸尽上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，在酶标仪上490 nm波长处测每孔的吸光度(A)值，并取5孔的平均值，细胞生长抑制率=(对照孔A值-实验孔A值)/对照孔A值×100%。本实验重复3次，最终取平均值。

1.6　实验分组

根据Crocin、DDP作用48 h的半数抑制浓度IC50及Crocin母液的浓度，实验分组：1)对照组(Control)；2)C1(0.8μg/mL DDP)组；3)C2(1.6μg/mL DDP)组；4)Z1(8mg/mL Crocin)组、Z2(16 mg/mL Crocin)组、C1+Z1(0.8μg/mL DDP+8mg/mL Crocin)组、C1+Z2(0.8μg/mL DDP+16mg/mL Crocin)组、C2+Z1(1.6μg/mL DDP+8mg/mL Crocin)组、C2+Z2(1.6μg/mL DDP+16mg/mL Crocin)组。

1.7　统计学处理

用统计软件SPSS17.0分析，计量资料以均数±标准差(±s)，各组间比较采用单因素方差分析，同一药物浓度下两组间比较采用两样本均数比较t检验，以P<0.05表示显著性差异。

2结果

2.1　低氧48 h对胃癌BGC-823细胞增殖的影响

倒置显微镜下观察BGC-823细胞形态：细胞成簇生长，量多密集，细胞大小基本一致(图1)。2%低氧下BGC-823细胞大量死亡，以培养的293T细胞和L929细胞作为参考，生长基本正常；5%低氧下培养的BGC-823细胞数量有所减少(图2)。MTT示：低氧48 h BGC-823细胞OD值(0.554±0.028)与常氧48 h OD值(0.694±0.043)相比存活细胞减少，P<0.01(表1)。提示：低氧抑制BGC-823细胞增殖。

常氧5%低氧

图1常氧、5%低氧对BGC-823细胞增殖的影响图

Figure 1BGC-823 cell proliferation under hypoxia(5% O2)and normoxia

L929　　　　　　　　　　　　　　　　293T　　　　　　　　　　　　　　　　　BGC-823

2.2　低氧条件下顺铂对胃癌BGC-823增殖的影响

常氧下DDP作用BGC-823 48 h的IC50为1.634 μg/mL。从倒置显微镜下观察，低氧下DDP处理BGC-823细胞48 h后的细胞数量明显减少，细胞固缩(图3)。MTT示：在低氧条件下C1、C2抑制率(分别为30.2%、52.7%)高于低氧对照组(20.8%)，差异均有统计学意义(P<0.01，表2)，低氧条件下C1、C2抑制率低于在常氧下抑制率(分别为34.9%、59.4%)(P<0.01，表1)。提示：低氧可能增加BGC-823细胞对DDP的耐药性。

表1 Crocin对BGC-823细胞的增殖抑制率

※：与低氧对照组比较，P<0.01；▲：与C1组比较，P<0.01.

图3　低氧下顺铂对BGC-823增殖的影响图

2.3　Crocin在低氧条件下对BGC-823细胞增殖的影响

常氧下Crocin作用BGC-823 48 h的IC50为28.129 mg/mL。从倒置显微镜下观察，在低氧下Crocin(8、16mg/mL)作用BGC-823细胞48 h后，BGC-823细胞数量无明显减少，细胞形态无明显改变，细胞体积大小基本一致(图4～5)。MTT示(表2)：在低氧下，加入Crocin 16 mg/mL 48 h即刻OD值为0.657±0.038，与低氧对照组(OD 0.554±0.028)比较，存活的细胞增多，P<0.05。提示：在低氧下一定浓度Crocin可能对BGC-823细胞有一定保护作用。

Crocin 8 mg/mLCrocin 16 mg/mL

图4常氧下Crocin作用于BGC-823细胞的影响(×20)

Figure 4Effect of Crocin on BGC-823 cells proliferation under normoxia(×20)

Crocin 8 mg/mL　　　　　　　Crocin 16 mg/mL

2.4　Crocin联合DDP在低氧下对BGC-823细胞增殖的影响

5%低氧下C1+Z1组作用BGC-823细胞48 h，其抑制率为34.7%，与C1组(30.2%)比较，抑制率下降；C1+Z2组抑制率为22.3%，与C1组比较，抑制率下降，P<0.01。C2+Z1组作用BGC-823细胞48 h抑制率为37.2%，与C2组(52.7%)比较，抑制率下降，P<0.01；C2+Z2组抑制率51.4%，与C2组比较，抑制率下降但无统计学意义(表2)。提示：在低氧条件下一定浓度的Crocin对BGC-823细胞可能起保护作用，从而抑制DDP对BGC-823细胞的杀伤作用。

表2 DDP联合Crocin低氧下对BGC-823细胞48h的增殖抑制率

※：与低氧对照组比较，P<0.01；▲：与C1组比较，P<0.01；★：与C2组比较，P<0.01；◆：与Z1组比较，P<0.01；●：与Z2组比较，P<0.01；■：与C1+Z1组比较，P<0.01；＊：与C1+Z2组比较，P<0.01；#：与C2+Z1组比较，P<0.01.

3讨论

低氧是人类和动物肿瘤的共同特征，它是肿瘤发展过程中所必须经历的环境条件之一。由于肿瘤细胞存在对缺氧的自身调节和适应，短时间的低氧可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，但持续缺氧可以促进细胞凋亡[6]。事实上，低氧对不同肿瘤细胞株增殖、凋亡的敏感性不同。Horiuchi等[7]的研究结果显示缺氧对卵巢癌细胞株细胞数目影响不明显。张亚莉[8]的研究结果显示低氧处理HL-60细胞后，生长却明显受抑制。我们的研究显示，BGC-823细胞置2%低氧下48 h 时大量死亡，5%低氧作用48 h时OD值低于常氧下值。提示：BGC-823细胞增殖对低氧比较敏感。

现研究发现[9]，缺氧处理肿瘤细胞对于许多化疗药存在抵抗。目前公认[10]的机制主要有以下四种：1)环磷酰胺、铂类、多柔比星等是氧依赖性的化疗药物，其在细胞内生成自由基，夺获电子然后传递给氧，从而对肿瘤细胞起杀伤作用。2)缺氧通过对肿瘤细胞基因组和蛋白组表达的调控，可以诱导基因突变，增加基因不稳定性和异质性，进而导致耐药。3)肿瘤缺氧通常伴随血液流变学的异常，随着弥散距离的增加，有些药物在半衰期内无法从血管弥散到肿瘤细胞，肿瘤局部药物浓度低，使肿瘤细胞免遭破坏。4)缺氧的细胞远离血管，远离血管的肿瘤细胞逃离了药物的作用。我们的研究显示，从倒置显微镜下观察，常氧下DDP处理BGC-823细胞48 h后的细胞数量明显减少，细胞固缩。随着DDP浓度的增加，其对BGC-823细胞抑制增殖作用增强。低氧条件下1.6 μg/mL DDP处理BGC-823 48 h即刻，其抑制率低于在常氧下抑制率(P<0.01)。提示：低氧可能增加BGC-823细胞对顺铂的耐药性。

Crocin的细胞保护作用在近年来备受争议。现已有研究表明，Crocin能有效抑制活性氧自由基的产生及黄呤氧化酶的活性，表现出抗氧化生物活性。其多种药学作用可能与此相关，如延长低氧小鼠的存活时间[11]，保护低氧心肌细胞[12]，抑制化疗药物引起的肝损伤[13]等。丁雯雯[14]等研究显示，适宜浓度的Crocin可显著增强体外造血干祖细胞集落形成，对造血干祖细胞具有保护作用。Crocin通过提高超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-px)及过氧化氢酶(catalase CAT)抗氧化酶的活性，减轻了顺铂对小鼠肝肾的氧化损伤，对顺铂引起的小鼠急性肝肾毒性具有良好的保护作用[15]。

我们的研究显示，BGC-823细胞加入Crocin在低氧下作用48 h，其OD值增加，且随着Crocin浓度增高而增加。5%低氧下Crocin联合DDP作用BGC-823细胞，其抑制率明显低于单用DDP(P<0.05)，且随Crocin浓度的增加，细胞的抑制率下降。提示：在低氧条件下一定浓度的Crocin对BGC-823细胞可能起保护作用，抑制DDP对BGC-823细胞的杀伤作用。但还需体内、体外实验进一步验证。这也是首次发现Crocin在低氧下对部分肿瘤细胞可能起保护作用。是否低氧下Crocin通过抗氧化生物活性对BGC-823细胞产生保护作用需进一步证实。

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