青海藏、汉族肺结核患者N-乙酰基转移酶2基因型比较*

刘汉芸，关　巍，白振忠，乌仁塔娜，冯喜英，李　贺

(1.青海大学医学院；2.青海大学附属医院呼吸科)

青海藏、汉族肺结核患者N-乙酰基转移酶2基因型比较*

刘汉芸1，关巍2**，白振忠1，乌仁塔娜1，冯喜英2，李贺1

(1.青海大学医学院；2.青海大学附属医院呼吸科)

摘要目的了解N-乙酰基转移酶2(NAT2)的基因型及其代谢表型在青海省藏、汉族肺结核患者之间的分布。方法采用实时荧光定量PCR Taqman探针法检测114例肺结核患者(年龄18～79岁，藏族69例，汉族45例) NAT2基因的重要单核苷酸多态性(SNP)位点基因型，并判定代谢表型，比较两个民族的基因型及代谢型是否存在差异。结果青海省藏、汉族肺结核患者NAT2基因 7个SNP位点基因型比较无显著性差异(P>0.05)。两个民族NAT2代谢型比较无显著性差异(P>0.05)。青海省藏、汉族肺结核患者NAT2的7个SNP位点基因型都以野生纯合型和杂合突变型为主。两个民族肺结核患者NAT2代谢型均以快代谢型和中间代谢型为主，其中藏族肺结核患者快代谢型、中间代谢型、慢代谢型频率分别为40.58%、49.28%、10.14%，汉族肺结核患者为51.11%、35.56%、13.33%。结论青海省藏、汉族肺结核患者的NAT2基因型和代谢型无显著性差异。

关键词NAT2肺结核藏族汉族

通信作者：刘汉芸(1987～)，女，汉族，青海籍，2012级科学班研究生.**教授，主任医师，博士，weiguan110@163.com

*：青海省(应用)基础研究计划项目(2013-Z-728)

中图分类号R521

文献标识码识码A

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.02.003

AbstractObjectiveThe aim of this study was to observe the genotype and phenotype polymorphism of NAT2 in Tibetan and Han patients with tuberculosis in Qinghai province.Methods A total of 114(45 Hans and 69 Tibetans)patients with pulmonary tube rculosis in Qinghai province，aged from 18 years to 79 years，were enrolled in this study.Genotype was test by Taq Man probe real-time PCR method，and metabolic phenotypes were identified by genotype．Results There was no difference in the genotype and metabolism of NAT2 in Tibetan and Han with pulmonary tuberculosis.The mainly genotype of NAT2 was wild homozygous and heterozygous in Tibetan and Han with pulmonary tuberculosis patients.The main metabolic types were the fast metabolism and middle one in both Tibetan and Hans.The number of slow metabolic type was least.The rate of fast，middle and slow metabolic types was 40.58%，49.28% and 10.14%，respectively，in ethnic group of Tibetan. Whereas，the rate of fast，middle and slow metabolic types was 51.11%，35.56% and 13.33%，respectively，in group of Han.Conclusion There was no difference in genotype and metabolic type of NAT2 in Tibetan and Han patients with pulmonary tuberculosis.

KeywordsNAT2TBTibetanHan

收稿日期2014-12-12

COMPARISON OF NAT2 GENOTYPE IN TIBETAN AND HAN

PATIENTS WITH TUBERCULOSIS IN QINGHAI PROVINCE

Liu Hanyun1，Guan Wei2**，Bai Zhenzhong1，Wuren Tana1，Feng Xiying2，Li He1

(1.Qinghai University Medical College；

2.Department of Respiratory Medicine，the Affiliated Hospital of Qinghai University)

1990年Blum等[1]发现了NAT2基因，从1995年Bell等[2]首次发现了NAT2的基因多态性到现在，目前已发现的NAT2多态性位点达40个之多，每年不断有新的位点被发现。由于NAT2多态性存在种族及地区差异[3-4]，因此对少数民族的NAT2多态性位点进行研究尤为重要，查阅国内相关文献，已经有学者研究了部分少数民族的NAT2基因型。由于藏族是青海省少数民族之一，且藏族肺结核发病率也较高，目前未见与藏族肺结核患者的NAT2基因型相关的相关报道，因此研究藏族肺结核患者的NAT2基因型可以为临床合理用药提供参考。

1对象与方法

1.1　研究对象

选择2013年12月～2014年5月在青海大学附属医院及青海省第四人民医院确诊的肺结核患者114例，其中藏族患者69例，男性41例，女性28例，平均年龄(38.3±12.0)岁；汉族患者45例，男性29例、女性16例，平均年龄为(42.8±16.6)岁。诊断标准为2001年中华医学会《肺结核诊断和治疗指南》[5]。

1.2　实验仪器和试剂

水平电泳仪(DYY-III稳压电泳仪 北京六一仪器厂)；分光光度计(DU800 Beckman Coulter 美国)；低温高速离心机(Eppendorf 德国)；ABI7500荧光实时定量PCR仪(ABI公司 美国)；人全血基因组DNA提取试剂盒(Qiagen 德国)；TaqMan荧光探针(ABI公司 美国)；SuperReal 荧光定量预混试剂(probe，FP206-02天根生化科技有限公司)。

1.3　实验方法

1.3.1基因组DNA提取

清晨空腹抽取肘静脉血5 mL，放入EDTA抗凝管，采用人全血基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，溶于TE缓冲液中，经凝胶电泳跑胶及紫外分光光度计测浓度后，于-20 ℃冰箱保存。

1.3.2NAT2多态性位点选择

根据http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term=NAT2网站选择NAT2多态性位点，分别为rs1799930、rs1801279、rs1801280、rs12720065、rs1280、rs1041983、rs1799929。

1.3.3NAT2基因型检测

购买ABI公司原装TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assay，具体探针检测序列见表1。NAT2反应体系：2×SuperReal PreMix(Probe)10 μL，TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assay 1 μL ，DNA模板8.75 μL、50×ROX Reference Dye 0.25 μL 。反应条件：95 ℃预变性15 min；95 ℃变性3 sec、60 ℃退火32 sec、60 ℃延伸32 sec，循环40次。

表1　NAT2 TaqMan探针检测序列表

1.3.4NAT2基因型判定

依据http：//nat.mbg.duth.gr/Human%20NAT2%20alleles_2013.htm网站判读NAT2基因型，7个位点所涉及的单体型及代谢表型见表2。

表2　NAT2基因型及代谢表型判定表

1.4　统计学方法

使用SHEsis在线软件统计各SNP位点基因型频率和等位基因频率，并检验各SNP位点等位基因频率是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，用SPSS 19.0(IBM SPSS Statistics)统计软件进行χ2检验，比较藏、汉族基因型频率，检验水准α=0.05。

2结果

2.1　NAT2 SNP等位基因频率及基因型频率(表3，图1~7)

表3显示，藏、汉族肺结核患者NAT2 SNP基因型比较无明显差异(P>0.05)。三个位点分别为rs1801279、rs12720065、rs1208，海氏检验P<0.05，不符合遗传平衡定律，考虑原因为样本量偏少出现偏倚。

2.2　NAT2基因代谢型频率(表4)

根据表2判定代谢型。表4显示，青海省藏、汉族肺结核患者NAT2代谢型主要以快代谢型和中间代谢型为主，其中藏族肺结核患者快、中、慢代谢型频率分别为40.58%、49.28%、10.14%，汉族为51.11%、35.56%、13.33%。比较藏、汉族代谢型无明显差异(P>0.05)。

表3　藏、汉族肺结核患者NAT2 SNP位点等位基因频率及基因型频率

表4 藏、汉族NAT2代谢表型比较 (%)

图1NAT2 rs1799930基因分型结果示意图

Figure 1Genotype of rs1799930 polymorphic site of the NAT2

图2NAT2 rs1801279基因分型结果示意图

Figure 2Genotype of rs1801279 polymorphic site of the NAT2

图3NAT2 rs1801280基因分型结果示意图

Figure 3Genotype of rs1801280 polymorphic site of the NAT2

图4NAT2 rs12720065基因分型结果示意图

Figure 4Genotype of rs12720065 polymorphic site of the NAT2

图5NAT2 rs1208基因分型结果示意图

Figure 5Genotype of rs1208 polymorphic site of the NAT2

图6NAT2 rs1041983基因分型结果示意图

Figure 6Genotype of rs1041983 polymorphic site of the NAT2

图7　NAT2 rs1799929基因分型结果示意图

3讨论

本研究结果显示，青海省藏、汉族肺结核患者的NAT2基因型和代谢型无显著性差异。

青海藏族肺结核发病率明显高于汉族[6]。抗痨药物(异烟肼等)其乙酰化速率影响了药物疗效[7-8]，并与药物副反应相关，导致异烟肼等代谢速率不同的主要原因是NAT2具有遗传多态性[9]。已有研究显示根据NAT2基因型及代谢型选用异烟肼药物剂量可提高疗效，减少药物性肝损害[10]。目前缺乏对青海藏族NAT2基因型及表型的研究。本研究对青海省藏、汉族肺结核患者的NAT2的重要多态性位点进行检测、分析，以了解藏、汉族之间基因型是否存在差异，同时了解藏族肺结核患者NAT2代谢型的分布情况，为药物个体化治疗提供理论依据。

NAT2基因多态性具有显著的种族和地区差异，其等位基因突变的发生导致酶活性下降、稳定性降低及表达量减少使得乙酰化代谢能力受损，造成个体对疾病易感性的差异。研究显示我国人群中NAT2基因型以NAT2*4/*4纯合野生型基因为主，NAT2*4/*6、NAT2*4/*7基因型常见，慢乙酰化代谢型基因在我国少见，主要有NAT2*6/*7[11-12]。本研究45例汉族肺结核患者4个NAT2 SNP位点rs1799930、rs1801280、rs1041983、rs179992基因型与国内相关研究基本一致。查阅相关文献未发现藏族NAT2基因型的研究，本研究发现69例藏族肺结核患者4个NAT2 SNP位点rs1799930、rs1801280、rs1041983、rs179992基因型以野生型为主，杂合突变型频率为49.27%。结果提示，藏族肺结核患者在以上4个位点出现了一定程度的突变，说明藏族肺结核患者和汉族肺结核患者一样在这几个位点也存在多态性，在以后的研究中这几个位点的检测必不可少。本研究有三个位点(rs1801279、rs12720065、rs1208)不符合遗传平衡定律，考虑原因为样本量偏少出现偏倚。

国外有研究发现NAT2基因多态性分布与结核病的遗传易感性之间有一定关系[13-14]。李昕洁等[15]研究发现我国汉族肺结核患者与健康人群间的具有不同的NAT2基因特征。刘芳等[16]的研究发现汉族健康人群NAT2 SNP位点rs1799929的基因型CC、CT、TT的频率分别为98.8%、1.2%、0，而本研究汉族肺结核患者在该位点上的基因型CC、CT、TT频率分别为28.89%、68.89%、2.22%，两者比较χ2=125.582(P<0.05)存在明显差异，该位点多态性与肺结核易感还应做进一步研究，但由于目前没有藏族NAT2基因型的研究资料，因此还不能比较，是否同样该位点多态性与肺结核易感需要更多的研究。

不同患者药物代谢率不同，造成疗效和副反应不同。药物在体内的代谢都有相应的药物代谢酶参与，人们已经发现药物代谢酶在人群中存在遗传多态性，这种特性决定了药物代谢酶在个体中的活性差异，从而导致药物反应的个体差异。NAT2基因的多态性影响了NAT2酶的活性，NAT2基因型对预测药物的药效和不良反应十分重要，根据NAT2基因型检测结果预测NAT2的代谢能力，制定异烟肼(INH)的个体化抗结核治疗方案将大大提高INH的治疗效果，降低不良反应的发生率及发生程度。有研究显示[10]，对慢乙酰化结核患者选择2.5 mg/kg剂量，快乙酰化者给予7.5 mg/kg剂量，中间型给予5 mg/kg的剂量分别给药，明显减少药物所致的肝损害，并减少早期治疗失败。在INH剂量相同的情况下，个体间INH血药浓度仍有非常显著的差异，有人发现，服用INH后2 h血药浓度差异可达100～200倍[17]。INH在体内主要代谢途径是经NAT2代谢为乙酰异烟肼(AcINH)，因此慢乙酰化的存在是INH及AcINH血药浓度存在着显著个体差异的重要原因[18]。Kita T等[19]研究了INH尿排回收率与NAT2基因型的关系，发现野生型、杂合子型及突变型的INH尿排回收率分别为6.4%±2.2%、10.7%±2.2%和38.6%±6.4%，这些研究都证明了NAT2代谢能力与INH药动学参数的相关性。本研究发现青海省藏、汉族肺结核患者NAT2慢代谢表型频率分别为10.14%和13.33%。 结果提示，该类患者的尿排回收率高，NAT2酶活性低，INH不能进行及时有效的代谢，毒性物质在体内的滞留时间也比较长，INH副作用的发生率也可能会相应的提高。因此针对该类患者在抗结核过程中可能应该适当减少INH用量或延长用药间隔时间。研究结果显示，藏、汉族肺结核患者的快代谢型频率分别为40.58%、51.11%，提示该类患者INH在体内代谢速度快，对结核杆菌起主要抗菌作用的代谢产物异烟酸在体内停留时间短，导致抗菌效果下降。因此针对这类代谢型患者在INH的用药上可能应该适当增加用药剂量或缩短用药间隔时间。

本研究比较藏族和汉族肺结核患者NAT2基因型和代谢型，两者均没用显著性差异(P>0.05)。由于本研究样本量有限，种族间NAT2基因型存在的差异可能没能检测出来，因此还需更多大样本研究证实。

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