一氧化氮在TRAIL诱导凋亡中对p53和VCP蛋白表达的影响※

安　玲，纵　媛，吉栋德，王荣华，李正娥，曹成珠，苏占海#

(1.青海省人民医院；2.青海大学医学院；3.青海大学附属医院；4.青海红十字医院)

一氧化氮在TRAIL诱导凋亡中对p53和VCP蛋白表达的影响※

安玲1，纵媛2，吉栋德1，王荣华3，李正娥4，曹成珠2，苏占海2#

(1.青海省人民医院；2.青海大学医学院；3.青海大学附属医院；4.青海红十字医院)

摘要目的研究NO在TRAIL诱导凋亡过程中对p53和VCP蛋白表达的影响。方法利用Western blot蛋白印迹法检测各蛋白表达水平；用MTT方法检测细胞凋亡和caspase-3激酶激活状态。结果内源性NO表达产生的一氧化氮可提高TRAIL诱导的细胞凋亡率，同时增加caspase-3激酶激活活性。内源性NO对p53蛋白表达水平无影响，但是对VCP蛋白表达的上调有一定促进作用。结论内源性NO对管家基因p53蛋白无明显影响，但对与内质网压力相关的VCP蛋白有调节作用。

关键词TRAILiNOSp53VCP细胞凋亡

通信作者安玲(1981～)，女，汉族，青海籍，主治医师.#：，教授、博士、硕士生导师，email：suzhanhai@qhu.edu.cn

※：国家自然基金项目(81160259)；青海省自然科学基金面上项目(2013-Z-907)；青海省应用基础研究项目(2013-Z-726)

中图分类号R735

文献标识码识码A

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.02.005

AbstractObjectiveTo investigate the influence of nitric oxide(NO)on the p53 and valosin-containing protein(VCP)protein expression in the process of tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand(TRAIL)mediated apoptosis signal pathway.Method Through Western blot to detect the protein expression.The cell apoptosis and caspase-3 activity were analyzed by MTT.Results Endogenous nitric oxide enhances the TRAIL-induced apoptosis level，and it also promoted caspase-3 activity.The p53 protein expression has not been effected by inducible nitric oxide synthase(iNOS)expression，but VCP protein expression can be increased by iNOS expression after induction.Conclusion Endogenous NO shows no influence on the p53 expression，but it regulates reticulum pressure-related protein VCP.

KeywordsTRAILiNOSp53VCPcell apoptosis

收稿日期2014-11-29

THE INFLUENCE OF NITRIC OXIDE ON THE p53 AND

VCP PROTEIN EXPRESSION IN THE PROCESS OF

TRAIL-INDUCED APOPTOSIS SIGNAL PATHWAY

An Ling1，Zong Yuan2，Ji Dongde1，Wang Ronghua3，Li Zhenge4，Cao Chengzhu2，Su Zhanhai2#

(1.The people′s hospital of Qinghai Province；2.Qinghai University Medical College；

3.Qinghai University Affiliated Hospital；4.Qinghai Red Cross Hospital)

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)在调节细胞凋亡、免疫应答、炎症反应及细胞内其他信号传导途径中有重要作用[1-2]。研究发现，TRAIL可诱导肿瘤或有炎症反应、免疫反应的细胞进入凋亡信号，但是对正常组织或正常细胞的毒性几乎很小，一般不会引起正常组织或细胞发生凋亡。TRAIL诱导细胞进入凋亡主要包括其与细胞膜上受体结合形成凋亡诱导复合体，并激活半胱氨酸蛋白酶-8(pro-caspase-8)的前体成为活性状态体(caspase-8)。当caspase-8数量足以激活“死亡执行激酶”caspase-3时，细胞立刻进入凋亡；否则将通过Bid蛋白在线粒体中释放caspase-9激酶，最终使得细胞进入凋亡[3-5]。许多肿瘤组织，如结肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤等组织中发现可诱导性一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表达，肿瘤组织通过获得性iNOS后，可持续表达一氧化氮[6-8]。因一氧化氮对基因组、细胞及组织均有毒性，推测肿瘤组织通过表达iNOS激酶，释放一氧化氮，逃避免疫系统的监视。一氧化氮在体内外实验中均可以抑制细胞增殖，同时也可以在浓度较高时诱导细胞进入凋亡[9-11]。

内质网是细胞内最大的钙离子存储场地。内质网在受到细胞内外信号刺激、内质网内蛋白积累、加工异常，使得其功能发生改变，可引起细胞生理学、病理学异常，此异常变化称为内质网压力。已经报道和内质网压力有关的激酶caspase-12与FAS诱导的细胞凋亡有关。除了caspase-12激酶外，缬酪肽蛋白VCP(valosin-containing protein，VCP)蛋白表达程度也与内质网压力有关，VCP蛋白表达异常，将导致内质网结构发生变化，最终导致下游相关蛋白或激酶激活，从而诱导细胞进入凋亡[12-15]。P53蛋白对细胞增殖、凋亡、分化、衰老以及基因组稳定均有调节作用，影响到整个细胞生物功能的各个方面，因此被称为“管家基因”。但是iNOS在TRAIL诱导的细胞凋亡过程中，是否对VCP和p53蛋白表达有调节作用，未见研究报道。本研究利用稳定转染细胞株EcR293，研究iNOS表达产生内源性一氧化氮在TRAIL诱导凋亡过程中对VCP和p53蛋白表达的调节作用，从而阐明内源性一氧化氮对内质网压力的影响。

1材料与方法

1.1　材料

1.1.1实验对象

用人胚胎肾细胞HEK293成功构建了EcR293细胞株，并对该细胞株稳定转染iNOS重组质粒，通过加入ponasterone A或不加该试剂，诱导细胞稳定表达iNOS，从而产生内源性一氧化氮。

1.1.2主要仪器及试剂

Binder 细胞培养箱(Tuttlingen，德国)，DMEM(Invitrogen，英国)，胎牛血清(Invitrogen，英国)，Ponasterone A诱导剂(Invitrogen，英国)，Lipofectamine 2000细胞转染试剂(Life Technology，美国)，NP-40 裂解液(上海生工生物公司，上海)；iNOS多克隆抗体、VCP单克隆抗体、p53单克隆抗体(Santa Cruz，美国)，anti-Mouse secondary antibody(Sigma-Aldrich Corp，美国)。

1.2　方法

1.2.1细胞培养及转染

EcR293细胞用DMEM细胞培养液进行培养(内含10%胎牛血清、1%p/s双抗、1% HEPES缓冲液，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养)。所有重组载体通过Lipofectmine 2000试剂进行转染，其转染效果通过Western blot蛋白印迹法进行检测。

1.2.2Western blot 蛋白印迹法检测

将待测细胞用细胞裂解液NP-40进行孵育和充分裂解、离心，并提取总蛋白上清，加入核酸降解酶以降解DNA和RNA，并在95 ℃变性5 min后，上样于12% SDS-PAGE电泳凝胶中进行电泳分离；然后将凝胶蛋白转移到PVDF膜上，经5% I-Block 37 ℃封闭1 h；加入相应一抗进行孵育培养，之后用缓冲液进行三次清洗，再加二抗进行孵育培养。将PVDF膜与发光工作液充分接触，室温孵育1 min，在暗室进行曝光、显影和定影，并将结果扫描于电脑上进行保存。

1.2.3Caspases-3活性检测

EcR293细胞富集程度到达50%左右时，立刻用胰酶分离后将其分到6孔培养板中，按浓度加入ponasterone A诱导剂(浓度为0、0.5、1、3、5μM )并孵育24 h，以便诱导iNOS基因产生内源性一氧化氮。之后用TRAIL(50ng/mL)处理24 h，用1000 μL 1% NP-40裂解并悬浮细胞，在冰上孵育15 min。对蛋白进行定量后，40 μg蛋白利用caspase-3活性检测试剂盒进行活性检测。所有反应样品在37 ℃黑暗状态孵育2 h。将80 μL经过孵育的样品加入到24孔黑色样品检验板，在405/535波长处检验其荧光光密度值，并将结果保存于电脑进行分析。

1.2.4细胞凋亡MTT法检测

待测细胞培养板孔中加入10 μL MTT溶液，并继续培养孵育4 h；之后加入400 μL Formanzan溶解液继续在培养箱内进行孵育培养，待紫色物质完全溶解后在全波长酶标仪波长570 nm处检测。

2结果

2.1　一氧化氮增加TRAIL诱导的细胞凋亡率

为检测内源性NO对TRAIL诱导的细胞凋亡的影响，将生长到50%富集度的EcR293细胞分离到6孔培养板中，在加入ponasterone A 诱导剂0、0.5、5 μM 3h时间点，立刻加入TRAIL(30ng/mL)诱导细胞凋亡。继续培养24 h后，去除培养液并用1XPBS清洗一次，立刻用MTT方法检测其细胞凋亡率，并进行分析(图1)。结果显示，加入TRAIL后，可检测到细胞凋亡(图10 μM Pon.)，随着ponasterone A诱导剂浓度增加(图10.5和5 μM Pon.)，TRAIL诱导的细胞凋亡率亦有增加，说明iNOS表达产生的内源性一氧化氮可提高TRAIL诱导的细胞凋亡率。同时，caspase-3激酶激活表示细胞也进入凋亡过程。通过检测发现，内源性一氧化氮可提高caspase-3激酶激活率(图2)。

图1一氧化氮增加TRAIL诱导的细胞凋亡

Figure 1NO enhances TRAIL-induced apoptosis

图2　TRAIL诱导细胞凋亡后caspase-3激酶活性检测

2.2　iNOS基因表达对p53基因表达的影响

为分析iNOS表达对p53蛋白表达的影响，EcR293细胞用诱导剂Ponasterone A 0、0.5、5 μM诱导24 h后，立刻用NP-40裂解液进行充分裂解，并以Western blot蛋白印迹法检测其表达水平。结果显示，随着iNOS表达产生的内源性一氧化氮被诱导增加，p53蛋白表达水平却基本恒定，没有发生较大变化(图3)，提示p53基因或其产物不受iNOS表达的影响。

2.3　一氧化氮对VCP基因表达的影响

为分析iNOS基因表达产生的内源性一氧化氮对VCP蛋白表达的影响，EcR293细胞用诱导剂Ponasterone A 0、0.5、5 μM进行诱导24 h后，立刻用NP-40裂解液进行充分裂解，并以Western blot蛋白印迹法检测其表达水平。结果显示，随着iNOS被诱导表达导致内源性一氧化氮逐步增加，VCP蛋白表达水平亦有所增加(图4)，尤其在5 μM诱导剂加入时，VCP蛋白表达量比0 μM时要高，提示VCP蛋白表达受内源性一氧化氮表达的影响，或许暗示iNOS表达产生的内源性一氧化氮对内质网有压力。

图3iNOS对p53蛋白表达的影响图

Figure 3The effect of iNOS on p53 expression

图4　iNOS对VCP蛋白表达的影响图

3讨论

细胞凋亡不仅是生理性的细胞学过程，如组织或器官增殖、免疫应答中诱导损伤细胞进入凋亡，也是一种病理性细胞过程，如细胞损伤或炎症发生过程中，凋亡因子诱导细胞进入凋亡。其最大特征是维持细胞膜的完整性，保持溶酶体内的酶不被释放，细胞被分割成许多个凋亡小体，最终被吞噬细胞所消灭，而不引起机体炎症反应。一氧化氮作为信使在细胞内行使不同功能，如抵抗病原体、诱导肿瘤细胞进入凋亡、传递信号途径中的信息、调节血管增殖等。但是许多肿瘤细胞获得性获得iNOS基因表达，并通过表达一氧化氮，使得免疫细胞在监督肿瘤过程中被诱导凋亡，从使得肿瘤逃避免疫监视。TRAIL诱导的凋亡途径是除CD95之外的经典凋亡信号途径，该信号通道牵涉到细胞膜表面表达的凋亡受体、caspase激酶激活、线粒体及内质网相关蛋白。有研究发现，caspase-12与内质网压力相关，参与细胞凋亡过程；同时钙离子在此过程中也扮演一定角色[16-24]。肿瘤持续表达iNOS，从而产生内源性一氧化氮，其作用一直未被阐明。因此，研究iNOS在凋亡信号途径中的作用对理解细胞凋亡有重要意义。

本研究显示，内源性一氧化氮可增加TRAIL诱导的细胞凋亡，但是对管家基因p53蛋白表达没有调节或影响，而对与内质网压力有关的蛋白VCP有调节作用，说明iNOS在调节TRAIL诱导的细胞凋亡过程中，内质网也参与此凋亡过程。由于TRAIL对正常细胞毒性较小，对肿瘤等非正常细胞毒性较大(表现在诱导其凋亡)，内源性一氧化氮作用增加TRAIL诱导的细胞凋亡作用，有可能通过改变内质网压力相关蛋白这条途径实现。内质网在蛋白形成、加工和运输中起重要作用，一氧化氮是极强的氧化剂，也对正在形成、加工的蛋白有修饰作用，从而导致内质网蛋白功能异常，增加细胞凋亡率。因此本实验对理解一氧化氮在TRAIL诱导过程相关机制提供了重要的实验依据。

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