新藤黄酸联合阿霉素诱导人乳腺癌MCF－7细胞凋亡的研究

谢晨烨，张 凤，程 卉，苏婧婧，李庆林

（安徽中医药大学科研实验中心 省部共建教育部新安医学重点实验室，安徽 合肥 230038）

乳腺癌是全球发病率居首位的女性恶性肿瘤。统计结果显示，乳腺癌同样是我国女性最常见的恶性肿瘤，且发病率呈逐年上升趋势［1］。目前，对于乳腺癌的治疗仍以化学治疗为主，作为临床一线治疗乳腺癌的药物，蒽环类抗肿瘤抗生素阿霉素（adriamycin，ADM）及其衍生物的应用越来越普遍。然而化学治疗药物易出现耐药性，进而导致用药剂量加大，毒性和不良反应增加等不利因素。目前临床治疗已逐渐采用联合用药方案，以期提高疗效的同时不增加药物毒性，同时减少耐药性［2］。故本实验选用新藤黄酸（gambogennic acid，GNA）与 ADM作为目标药物进行研究，探讨其联合应用对人乳腺癌细胞MCF－7凋亡的影响。

1 材料

1．1 细胞株 人乳腺癌细胞 MCF－7，购于中国科学院上海细胞库。

1．2 药物 GNA为亮黄色结晶粉末，纯度＞99．0%，批号2012120101，由安徽中医药大学科研实验中心GNA课题组提供；ADM：浙江海正药业股份有限公司，批号120901。

1．3 主要试剂 达尔伯克培养基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）干粉：Gibco公司，批号 1218594；特级胎牛血清（fatal bovine serum，FBS）：天津市灏洋生物制品科技责任有限公司，批号20150530；Trypsin胰蛋白酶：Sigma公司，批号20120711125；甲 基 噻 唑 基 四 唑 （methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）：Sigam公司，批号 M2128；二甲基亚 砜 （dimethyl sulfoxide，DMSO）：Amresco 公司，批号 20120210；4′，6－二脒基－2－苯基吲哚（4′，6－diamidino－2－phenylindole，DAPI）染色液：碧云天生物技术研究所，批号c1002；膜联蛋白Ⅴ（annexinⅤ，AV）－异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）／碘化丙啶（propidium iodide，PI））细胞凋亡检测试剂盒：上海贝博生物公司，批号BB140041；其他试剂均为分析纯。

1．4 主要仪器 MCO－175CO2培养箱：日本Sanyo公司；LD4－8型低速离心机：北京医用离心机厂；96孔和6孔平底培养板：美国Corning costar公司；SPECTRA max M2e酶标仪：美国 Molecular Devices公司；JW2502电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司；Olympus CKX41倒置显微镜以及Olympus BX51荧光显微镜：日本 Olypus公司；FACS Calibur流式细胞仪：美国Becton Dickinson公司。

2 方法

2．1 细胞培养 将人乳腺癌细胞MCF－7接种于培养瓶中，培养基为DMEM（含10%FBS、青霉素100 U／ml和链霉素100U／ml），置于37℃、5%CO2培养箱，相对饱和湿度的条件下培养。细胞呈单纯贴壁生长，隔2～3d换液，待细胞长至70%～80%的密度，用不含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化传代，每2～3d传代一次。

2．2 MTT比色法测定细胞活力 消化收集对数生长期的MCF－7细胞并调整成浓度为4×104／mL的单细胞悬液，接种于96孔板，每孔接种100μL，接种24h后处理。倒置显微镜下观察确认细胞贴壁状态良好。加药组每孔分别加入100μL培养液配制的药物，使GNA终浓度分别为0．125、0．25、0．5、1、2、4μmol／L，ADM 终浓度则为0．5、1、2、4、8、16μmol／L。每一浓度设6个复孔，并设空白对照组，加入100μL培养液。培养24h后，弃上清，每孔加5mg／mL的 MTT 20μL，37℃，5%CO2培养箱孵育4h，吸去上层液体，以150μL DMSO溶解蓝紫色颗粒同时置于摇床上振摇至溶解完全，在全自动酶标仪上室温避光振荡混匀并于490nm波长测定各孔的光密度（optical density，OD）值，计算单独用药时细胞的存活率。并以此为基础，结合中效原理［3］检测两种药物不同剂量联合配伍后的MTT细胞活力。细胞存活率＝实验组OD值／对照组OD值×100%。

2．3 倒置显微镜下观察细胞形态 对数生长期的MCF－7细胞消化收集并调整成浓度为2×105／mL的细胞悬液，接种于6孔板中，每孔2mL。细胞置于37℃恒温、5%CO2培养箱中培养24h，当细胞长至70%时换用含有1μmol／L GNA、4μmol／L ADM、1μmol／L GNA＋4μmol／L ADM 的新鲜培养液，同时设空白对照组，细胞继续培养24h后于倒置显微镜下观察并拍照。

2．4 DAPI细胞核染色 将处于对数生长期的MCF－7细胞接种到6孔板中，每孔分别加入2mL细胞培养基。种板后24h，吸弃各孔中的旧培养液，加药组各孔中分别加入含 GNA 1μmol／L、ADM 4μmol／L、GNA 1μmol／L＋ADM 4μmol／L的培养基2mL，未给药组各孔中加入完全培养基2 mL。置37℃恒温培养箱中孵育24h后，弃各孔中原有培养液，以每孔1mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）轻洗细胞1次；再加入1mL 2%多聚甲醛固定15min，弃多聚甲醛，PBS 1mL漂洗细胞；再加入DAPI在室温下避光作用10min，最后PBS轻洗细胞1次，于荧光显微镜下观察并拍照。

2．5 流式细胞仪检测AV／PI双染 MCF－7细胞常规传代于培养瓶中，待细胞密度约为70%～80%时，加药组各瓶中分别加入含 GNA 1μmol／L、ADM 4μmol／L、GNA 1μmol／L＋ADM 4μmol／L的培养基4mL，未给药组中加入完全培养基4mL。24h后常规收集各组实验细胞，用PBS轻洗2次后，胰酶消化并吹散细胞转移置离心管中，2 000 r／min，离心5min，弃上清液。每管加1mL PBS轻洗2次，再次离心。400μL AV结合液重悬，分别加入5μL AV－FITC和10μL PI溶液，混匀细胞，避光孵育15min后，过筛至流式专用管内，1h内流式细胞仪检测。

2．6 统计学方法 所有数据均采用SPSS 17．0统计学软件进行统计学处理，连续型变量用“均数±标准差（±s）”进行统计学描述。多组均数比较采用单因素方差分析，均数之间多重比较采用LSD法。P＜0．05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3．1 GNA与ADM单独及联合应用对细胞活力的抑制作用 GNA和ADM单独作用于MCF－7细胞24h后，结果表明，与空白对照组比较，GNA和ADM均能明显抑制细胞增殖（P＜0．01）。而GNA和ADM作用 MCF－7细胞24h后的半数抑制率（inhibition concentration 50，IC50）分别为 3．115、9．304μmol／L。根据中效原理计算验证后选择1μmol／L GNA＋4μmol／L ADM 作为联合用药浓度。结果见图1、图2。

3．2 GNA与ADM单独及联合应用对细胞形态的影响 倒置显微镜下观察可见，空白对照组细胞贴壁牢固，细胞边缘清晰，体积较大，几乎无悬浮细胞。与空白对照组比较，1μmol／L GNA作用于 MCF－7细胞24h后，部分细胞边缘发亮，细胞固缩变圆，体积变小，少数细胞贴壁不牢，呈半贴壁状态。而4 μmol／L ADM 作用于 MCF－7细胞24h后，可观察到多数细胞固缩变圆，漂浮于培养液中。1μmol／L GNA和4μmol／L ADM 联合用药组作用 MCF－7细胞24h后，与单独用药组比较，其大多数细胞均漂浮于培养液中，部分细胞出现空泡或细胞破裂呈坏死状。见图3。

3．3 GNA与ADM单独及联合应用诱导的细胞凋亡 细胞发生凋亡时，染色质发生固缩［4］，DAPI可快速穿透细胞膜与细胞核内DNA链结合，同时对活细胞和凋亡细胞进行核染。本组实验中，荧光显微镜下可见空白对照组正常细胞核呈现均一暗淡的蓝色，而GNA与ADM单独用药24h后，部分细胞核呈蓝白色，碎块状致密浓染，少数细胞核可见细胞核内碎裂，具有明显凋亡特征。而联合用药组凋亡细胞数量较单独给药组明显增加，亮度趋向亮蓝白色。结果见图4。

3．4 GNA与ADM单独及联合应用对细胞凋亡率的影响 GNA与ADM单独和联合用药分别作用于MCF－7细胞24h后，流式细胞仪检测结果显示，与未给药组比较，单独用药组细胞凋亡率均显著上升（P＜0．01），而1μmol／L GNA＋4μmol／L ADM联合用药组细胞凋亡率较单独用药组显著升高（P＜0．01）。结果表明，GNA与ADM 联合用药诱导MCF－7细胞凋亡的作用显著优于单独用药，两药联用具有协同效应。见表1、图5。

表1 GNA与ADM单独和联合应用对MCF－7细胞凋亡率的影响（±s，n＝3）

表1 GNA与ADM单独和联合应用对MCF－7细胞凋亡率的影响（±s，n＝3）

注：含有相同右上标符号的组别相比较，P＞0．05；不含相同右上标符号的组别相比较，P＜0．05。

空白对照 2．37±0．32＊1μmol／L GNA 40．36±3．17＃4μmol／L ADM 42．06±3．03＃1μmol／L GNA＋4μmol／L ADM 联合用药 69．89±5．11△

4 讨论

乳腺癌发病率高，且颇具侵袭性，是女性最常见的恶性肿瘤之一［5］。近年来，随着手术、放射治疗、化学治疗、内分泌治疗和分子靶向治疗及中医中药等各种治疗方法的改进，乳腺癌患者的存活率有了一定程度的提高，因此，多学科综合治疗备受关注。临床已出现多种联合用药方案，其中以蒽环类与其他药物联用为主［6］。

联合用药是指为了达到治疗目的而采用的两种或两种以上药物同时或先后应用，以期提高疗效而不增加毒性，并减少耐药性的出现。联合用药时应选择作用机制不同的药物联用，从而发挥其协同作用［7］。化学治疗药物单独使用时毒性和不良反应严重，剂量稍大则容易对机体正常细胞功能产生影响，长期使用后恶性肿瘤容易对药物产生耐药性，导致疗效降低。这些均是妨碍各种恶性肿瘤治疗的难题，也是使得乳腺癌化学治疗失败的重要原因。联合用药方案则可结合传统中药和临床常用西药不同的作用机制，从而达到全面抑制恶性肿瘤发展，增加疗效并降低不良反应的目的。

GNA是一种传统中药，具有作用强、毒性低、稳定性好和抗癌谱广等特点。研究［8］发现GNA体外能够抑制多种类型的癌症细胞增殖，其抗肿瘤作用机制与诱导肿瘤细胞凋亡，抑制细胞增殖，阻滞细胞周期进程有关［9－12］。ADM 是一种蒽环类化学治疗药物，对机体可产生广泛的生物化学效应，具有强烈的细胞毒性作用。其作用机制主要是嵌入DNA后抑制核酸的合成，可抑制RNA和DNA的合成。ADM抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属细胞周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用［13］。

本实验结果表明，GNA和ADM单用或联合用药都能诱导人乳腺癌 MCF－7细胞的凋亡。MTT结果显示，两药单独或联合应用均可对乳腺癌MCF－7细胞造成生长抑制，并呈一定的剂量依赖性。而从DAPI细胞核染色实验观察得知，与单独用药组比较，GNA及ADM联合应用时能够显著诱导MCF－7细胞的凋亡，细胞核碎裂，具有明显凋亡特征。流式细胞仪检测结果则进一步证明了GNA与ADM联合应用诱导 MCF－7细胞的凋亡现象。从本实验可以看出：两药合用时，不仅对MCF－7细胞的凋亡效应增加，而且各自的需用量均比单用要小。这也充分说明这两种药物联合用药具有协同增效的作用，符合联合用药增效减毒的原则。

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