益气养阴生精方对微波辐射大鼠精子凋亡的影响

罗少波，李昌成，刘洪源，孙 静，徐少强，胡海翔

（1．中国中医科学院广安门医院南区，北京 102638；2．内蒙古自治区包头市包钢第三职工医院泌尿外科，内蒙古 包头 014010；3．黑龙江省大庆市中西医结合医院内二科，黑龙江 大庆 163515；4．中国人民解放军空军总医院康复医学科，北京 100142）

随着科技的发展，雷达、通讯、电脑电视等电磁微波辐射污染越来越严重。生殖系统是对微波辐射比较敏感的系统，从精原干细胞到精子成熟的过程中，任一环节遭受过量的微波辐射均可导致精子的异常。国内外的研究［1－3］表明，微波辐射对精子密度、畸形率和精子活动力均有一定的影响，但其对精子形态的影响研究较少。目前，电镜是精子形态学检测最客观可信的依据［4］。本研究对接受大剂量微波辐射的大鼠精子进行透射电镜观察，了解精子超微结构的变化，为研究微波辐射对精子形态、结构和功能的影响提供病理形态学依据。

1 材料

1．1 实验动物与分组 健康7周龄雄性Wistar大鼠72只，体质量（250±20）g，由军事医学科学院实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK（京）2013－0038。按体质量将其随机分为空白对照组（对照组）、高剂量1次辐射组（辐射组）、高剂量1次辐射加中药组（中药组），每组各24只。

1．2 主要仪器与试剂 微波模拟源：军事医学科学院核辐射防护研究室提供；离心机：德国Hermle公司生产，HERMLE2360K 型；WL－9000精子分析仪：北京伟力科技有限公司；细胞凋亡试剂盒：武汉博士德生物工程公司产品，批号 MK1023；精子孵育液：含有10mmol／L HEPES、140mmol／L NaCl、2．5mmol／L CaCl2，pH 值＝7．4。

1．3 益气养阴生精方［5］为本课题组治疗少精子症的常用有效方剂，主要由生黄芪、太子参、枸杞子等组成。取中药720g用7倍水浸泡1．5h，煎煮30 min，药渣用4倍水煎煮20min，最后二者混合浓缩成240mL。

2 方法

2．1 辐射及中药干预方法 微波辐射方法参考文献［6］的方案进行。

2．1．1 对照组 大鼠只置于辐射台上15min，不予辐照，常规饲养，自由摄取食水。

2．1．2 辐射组 取12只大鼠置于反射系数近似零的微波暗室，接受全身均匀辐照1次。辐照强度100mW／cm2，辐照时间15min，辐照环境温度稳定于（18±2）℃，湿度50%～70%。将大鼠从辐射室取出，每组6只置于饲养笼中，常规饲养，自由摄取食水。待辐射箱温度降至18℃后，对剩下的12只大鼠进行相同处理。

2．1．3 中药组 辐射方法同辐射组。辐射后第1天开始，每日8：00—9：00，按30g／kg灌服益气养阴生精方汤剂1次，持续7d。常规饲养，自由摄食摄水。

2．2 取材 于辐射后第14天颈椎脱臼法处死实验大鼠，迅速分离睾丸、附睾，摘除脂肪组织，分析天平称取质量。左侧睾丸、附睾横切为大致相等的两半，一半以苏木素－伊红染色，切片厚5μm，行组织学观察；另一半以5%多聚甲醛固定备用。右侧睾丸、附睾以一纵两横法剪为大致均匀6段，置于10mL精子孵育液中孵育30min，小心将上层液体（含精子）移至另一试管中备用。

2．3 精液常规检查 将上述所得精液吸取约100 μL，用WEILI－9000电脑精液自动分析仪测量精子密度。

2．4 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（terminal－deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）法检测精子凋亡 睾丸置于10%中性甲醛中固定24h，常规石蜡包埋、切片（4 μm），将已固定的标本转入0．5%Triton X－100中，37℃透化胞膜1h；清洗液为加入0．3%小牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer solution，PBS），清洗后，再将标本放入末端脱氧核苷酸转移酶和生物素标记核苷酸的混合液中，37℃孵育1h；清洗后转入异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的链霉亲合素中，37℃孵育20min，最后将标本移入50μg／mL碘化丙啶中复染15min。荧光显微镜下观察，细胞核中有棕黄颗粒者即为凋亡细胞。阴性对照组以PBS代替末端脱氧核苷酸转移酶反应液。精子凋亡率计算：每张切片取5个高倍视野，共计数500个细胞，求得阳性凋亡细胞率。

2．5 统计学方法 采用SPSS 11．0统计软件进行统计学分析。连续型变量采用“均数±标准差（±s）”进行统计学描述。多组间均数比较采用单因素方差分析，组间均数多重比较应用SNK检验。P＜0．05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3．1 各组每毫升睾丸组织上层培养液中精子总数和活跃精子数比较 与对照组比较，辐射组每毫升上层培养液中精子总数和活跃精子数均显著减少（P＜0．05）；与辐射组比较，中药组每毫升上层培养液中精子总数和活跃精子数显著升高（P＜0．05）。见表1。

3．2 各组精子凋亡率比较 与对照组比较，辐射组大鼠精子凋亡率显著升高（P＜0．05）；与辐射组比较，中药组大鼠精子凋亡率显著降低（P＜0．05）。见表1、图1。

表1 各组精子凋亡率和每毫升睾丸组织上层培养液中精子总数、活跃精子数比较（±s）

表1 各组精子凋亡率和每毫升睾丸组织上层培养液中精子总数、活跃精子数比较（±s）

注：同列含有相同右上标符号的组别相比较，P＞0．05；同列不含相同右上标符号的组别相比较，P＜0．05。

对照 24 16．7±5．1＊ 4．29±1．71＊ 15．6±2．3＊辐射 24 13．8±4．2＃ 2．57±1．16＃ 30．5±3．6＃中药 24 25．6±7．5△ 6．74±1．42△ 18．7±4．5△

4 讨论

众多的研究表明，睾丸是微波辐射最敏感的靶器官之一［7］，精子是雄性遗传信息的传递者，微波辐射可引起睾丸和附睾中精子形态异常的数量显著增多，附睾精子活力下降、畸形率增加、超微结构、遗传物质损伤［8］，造成生殖能力下降，而且可能将畸变遗传给子代。

在机体内部随时都在发生着细胞的死亡，传统上用显微镜来观察细胞的死亡，其特征为核染色质的浓缩及碎片形成，但这种现象出现很晚，时间也很短暂。凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质或DNA被切割，出现单链或双链缺口，并产生与DNA断点数目相同的3′－OH末端，末端脱氧核糖核苷酸转移酶可将地高辛标记的dUTP（DIG－dUTP）标记至3′－OH末端，DIG－dUTP结合在DNA断点部位，可以通过生物标记的抗地高辛抗体反应后，再结合链霉亲和素－FITC。FITC在490～495nm激化，在520～530nm发射荧光，呈黄绿色，凋亡的细胞核呈黄绿色，从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞，称为TUNEL法。TUNEL法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反映细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用［9－11］。

本课题组经常去中国人民解放军空军及雷达基地进行调研，对经常接受雷达微波辐射的基层官兵相关体检资料进行分析后认为，微波辐射属火热之邪，微波辐射作用于人体后首先耗伤人体之气，卫气受损，火热内传，消灼体内之津液，导致阴液不足，微波辐射损伤的致病机制在于气损及阴、气阴两伤，最终造成肾之真阴及元气的损伤，直接影响人类的生殖系统。针对其发病机制，治疗应以益气养阴生精为基本法则，通过补益气血阴液而使精气得到改善，并以益气养阴生精方为基础方进行辨证论治，在临床中得到较好的治疗效果。本实验结果证实，益气养阴生精方可以增加微波辐射损伤的精子总数和活跃精子数，降低微波辐射增加的精子凋亡率，从而改善微波辐射后大鼠的精子质量，达到提高微波辐射后大鼠的生殖能力的效果。

［1］王水明，彭瑞云，高亚兵，等．安多霖对微波辐射大鼠附睾精子参数的影响［J］．中国生育健康杂志，2012，23（3）：191－194．

［2］薛蕾，陈浩宇，王水明．亚急性微波辐射对大鼠精子运动参数及畸形率的影响［J］．环境与健康杂志，2012，29（7）：583－586．

［3］姚斌伟，彭瑞云，王水明．抗辐灵对微波辐射致大鼠精子损伤的防治作用［J］．中国体视学与图像分析，2012，17（2）：149－155．

［4］Baccetti B，Collodel G，Piomboni P．Apoptosis in human ejaculated sperm cells：notulae aeminalaeicae 9［J］．J submicrose Cytol Pathol，1996，28（4）：587－596．

［5］胡海翔，罗少波，孙静，等．益气养阴生精方对微波辐射雄性大鼠生殖的影响［J］．北京中医药大学学报，2013，36（4）：250－253．

［6］胡海翔，罗少波，孙静，等．微波辐射对雄性大鼠生殖系统的影响［J］．中国男科学杂志，2012，26（11）：12－14．

［7］周文，杨进清，王虚步，等．微波辐射对大鼠睾丸P450 scc mRNA表达水平的影响［J］．中华物理医学与康复杂志，2005，27（2），72－74．

［8］高晓芳，王水明，彭瑞云．电磁辐射对睾丸及附睾精子生物学效应的研究现状［J］．中华男科学杂志，2007，13（9）：826－829．

［9］董静，李明珠，毕克滨，等．原位末端标记法检测齐墩果酸诱导细胞凋亡的实验研究［J］．中医药信息，2013，3（3）：134－135．

［10］顾文彪，张仪，刘和香，等．原位末端标记法观察钉螺细胞凋亡的研究［J］．中国人兽共患病学报，2013，29（5）：456－459．

［11］方健，裴少保，吴健，等．兔脊髓冲击伤后神经细胞Bcl－2及Bax基因表达与原位末端标记法检测凋亡的比较［J］．中国骨与关节损伤杂志，2011，26（11）：995－997．