白 靓,成 岩,徐芳菲,刘 燕,张树军,曹瑞珍
(1.内蒙古民族大学生命科学学院生物化学与分子生物学教研室,内蒙古 通辽 028000;2.内蒙古民族大学医学院病原生物学与免疫学教研室,内蒙古 通辽 028000;3.吉林省集安益盛药业股份有限公司,吉林 集安 134200)
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是一种广泛存在人和动物体内的革兰阳性球菌,可以在皮肤、泌尿生殖道、消化道和呼吸道引起化脓性感染,严重者可以引起全身性脓毒血症[1]。金黄色葡萄球菌在漫长的进化过程中,出现了大量的耐药株,以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的威胁程度最大,其降低了抗生素疗法的可靠性,美国每年感染MRSA的新增患者达180万例[2]。铁调节表面决定因子B(ironregulated surface determinant B,IsdB)是存在于金黄色葡萄球菌体表面的一种蛋白抗原,相对分子质量约为72000,功能是从血红蛋白中捕获铁分子并向细菌内转运[3]。IsdB具有强免疫原性,在金黄色葡萄球菌中高度保守[4]。而IsdB最小构象表位位于50-285aa中,该片段诱导的抗体具有免疫调节作用[5],为进一步提高IsdB的免疫原性,本课题组尝试使用HBc作为疫苗载体。乙型肝炎病毒核心(hepatitis B virus core,HBc)蛋白作为载体具有佐剂特性,HBc截短成144aa后能携带外源蛋白表位诱导机体产生强适应性免疫应答,尤其可以产生针对外源表位的特异性抗体[6]。使用HBc作为载体的疫苗研究领域涉及结核杆菌、流感病毒、恶性疟原虫、艾滋病毒和黑色素瘤等[7]。张占东等[8]利用原核表达 HBc-VEGF融合蛋白,并通过免疫小鼠分析重组融合蛋白的免疫原性,发现小鼠能够产生针对VEGF抗原表位的特异性抗体,为肿瘤治疗研究提供了新方法。Yin等[9]使用HBc与炭疽芽孢杆菌PA抗原表位(302-325)融合表达,发现该抗原能够在小鼠及豚鼠体内产生保护性抗体,可作为疫苗预防炭疽感染。进一步分析融合抗原的免疫机制发现:删除HBc蛋白中的79-81aa的免疫显性区可以提高HBC蛋白的正确折叠及提高免疫效果[10]。而将HBc与金黄色葡萄球菌IsdB表位进行融合表达,国内外尚未见相关报道。本研究以HBc为抗原载体,与IsdB50-285蛋白融合表达,并评价该融合蛋白诱导小鼠产生抗体能力及免疫保护效果,为预防性金黄色葡萄球菌疫苗的研制提供参考。
1.1 实验动物、基因、质粒、菌株、主要试剂和仪器 40只BALB/c小鼠,雌性,4周龄,购自吉林大学实验动物中心,动物生产许可证号:SCXK(吉 ) 2008-0005;HBc(GenBank,JX848113.1),IsdB(GenBank,5330644 );pET28a(+)载体及其表达菌BL21(美国Novagen公司);大肠杆菌(DH5α)、金黄色葡萄球菌Newman株由内蒙古民族大学生生命科学学院生物化学实验中心保存;限制性核酸内切酶(美国Thermo公司),DNA相对分子质量标准、蛋白质相对分子质量标准 [天根生物科技(北京)有限公司],HRP标记的羊抗小鼠IgG(北京中杉金桥公司),rIsdB蛋白由内蒙古民族大学生物化学实验室制备保存,弗氏佐剂(美国Sigma公司),BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术公司);Amicon Ultra-15超滤离心管(截留相对分子质量为3000,美国Millipore公司)。
1.2 基因设计与合成 依据GenBank公布的序列,设计目的基因HBc-IsdB50-285,IsdB50-285(236aa)插入替换 HBc(N端1~144aa)的第76~82位aa,见图1。基因上游引入NcoⅠ序列,下游引入XhoⅠ序列。基因由上海生工公司合成,质粒命名pUC57-HBc-IsdB50-285。
图1 HBc蛋白构建示意图Fig.1 Schematic diagram of construction of HBc protein
1.3 pET28-HBc-IsdB50-285载体构建与表达 使用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切pUC57-HBc-IsdB50-285和pET28a(+)质粒。回收试剂盒分别回收目的基因与载体,连接后转化大肠杆菌,经酶切、测序鉴定阳性载体。将鉴定含有 pET28-HBc-IsdB50-285的BL21(DE3)菌株接种于10mL含卡那霉素的LB培养液中培养12h,培养产物以1∶50接种于50mL LB培养液中,37℃振荡培养至600nm处吸光度A600=0.5~0.8时,取出5mL作为未诱导对照,剩余培养液加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,终浓度为 0.5mmol L-1,培养6h。取2管菌液每管1mL检测蛋白表达情况及目标蛋白的可溶性,12000r·min-1离心10min,一管保留菌体备用;另一管弃上清更换缓冲液(250mmol·L-1NaCl,20mmol·L-1Tris-HCl,pH7.9,0.1mmol·L-1DTT)重悬,冰浴条件下超声破碎菌体后,12000r·min-1离心10min,分别对全菌体与超声破碎上清进行12%SDSPAGE分析。
1.4 HBc-IsdB50-285的纯化 根据目的蛋白 C 末端携带组氨酸标签,选择镍柱亲和层析纯化目的蛋白,取超声破碎菌液30mL调pH 值至7.9,0.45μm滤器过滤后上样至经0.2mol·L-1NiSO4洗涤的Chelating Sepharose FF 10mL柱,结合缓冲液(250mmol·L-1NaCl,20mmol·L-1Tris-HCl,10mmol·L-1咪唑,pH7.9),平衡上样后梯度洗脱收集洗脱峰,洗脱缓冲液(250mmol·L-1NaCl,20mmol·L-1Tris-HCl,300mmol·L-1咪唑,pH7.9),12%SDS-PAGE鉴定纯化的目的蛋白。BandScan 5.0分析软件分析电泳结果,计算蛋白纯度,对纯化蛋白使用超滤离心管除去咪唑及更换缓冲液为PBS,参照BCA蛋白定量试剂盒,取0.1mL纯化蛋白进行蛋白定量。
1.5 动物分组及给药 40只BALB/c小鼠随机分为 HBc-IsdB50-285组、HBc-IsdB50-285添加佐剂组、rIsdB添加佐剂组和PBS组,每组10只。第0天和第11天小鼠腿部肌肉注射2次,剂量为每只100μg。首次与弗氏完全佐剂等体积混合,末次与弗式不完全佐剂等体积混合。小鼠免疫后在第11和20天尾静脉采血(每次0.1mL)。
1.6 小鼠血清抗 HBc-IsdB50-285抗体检测 使用间接ELISA法,分别取rIsdB、HBc-IsdB50-285100μL包被酶标板,每孔0.4μg,次日置于200μL含有BSA的封闭液中反应1h。分别检测4组免疫小鼠的血清,小鼠血清按1∶100倍稀释的初始浓度加入酶标板内100μL,按1∶100倍比稀释法稀释(阴性对照,每孔为PBS免疫的动物血清),37℃孵育1h,洗涤液冲洗5遍后加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶1000),每孔100μL,室温反应2h,洗涤及TMB显色,用酶标仪测每孔A450值,样品A450值≥2.1×阴性对照A450值即判定为阳性。
1.7 小鼠攻毒实验 取-80℃冻存的金黄色葡萄球菌液30μL接种至10mL TSB复壮培养。取1mL培养菌接种入50mL TBS培养液中放大培养,当 A600=1.0 时,取细菌5000r·min-1离 心5min,PBS缓冲液重悬,平板计数法测定细菌数目,稀释定量至2×1013L-1后,对各组小鼠进行攻毒试验,每只小鼠腹腔注射300μL细菌,即每只小鼠6×1010CFU[11],观察14d,记录各组小鼠死亡数。
1.8 统计学分析 采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。各组小鼠血清特异性抗体效价以表示,组间比较采用配对t检验;攻毒保护率组间比较采用Fisher精确概率法。
2.1 质粒载体酶切鉴定 pUC57-HBc-IsdB50-285质粒采用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后,经琼脂糖凝胶电泳,获得片段长度约为2700bp和1140bp(图2);pET28-HBc-IsdB50-285质粒采用XhoⅠ 与XbaⅠ双酶切后,经琼脂糖凝胶电泳,获得片段长度约为1180bp和5200bp(图3),结果与预期一致。
图2 pUC57-HBc-IsdB50-285经 NcoⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定电泳图Fig.2 Electrophoregram of pUC57-HBc-IsdB50-285digested by NcoⅠand XhoⅠrestriction enzyme
图3 pET28-HBc-IsdB50-285经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定电泳图Fig.3 Electrophoregram of pET28-HBc-IsdB50-285digested by XhoⅠand XbaⅠrestriction enzyme
2.2 重组蛋白和纯化蛋白产物的鉴定 HBc-IsdB50-285表达产物全菌体和超声破碎上清经SDS-PAGE分析,可见目标条带在相对分子质量44000处存在差异,且目的蛋白部分可溶,存在于表达上清。纯化蛋白经12%SDS-PAGE分析,在相对分子质量44000处可见清晰单一条带(图4),纯度约为90%,浓缩后蛋白表达水平为1.0g·L-1。
2.3 各组小鼠体内特异性抗体滴度的效价值 间接ELISA法检测小鼠血清特异性IgG,采用rIsdB作为包被抗原在20d检测免疫小鼠IgG效价显示:rIsdB添加佐剂组小鼠血清特异性抗体滴度的效价值高于 HBc-IsdB50-285添加佐剂组(P<0.01),见表1。采用 HBc-IsdB50-285作为包被抗原在20d检测IgG效价显示:HBc-IsdB50-285添加佐剂组小鼠血清特异性抗体滴度的效价值高于rIsdB添加佐剂组和HBc-IsdB50-285组(P<0.01)。见表2。
图4 重组蛋白和纯化蛋白SDS-PAGE电泳图Fig.4 SDS-PAGE electrophoregram of recombinant and purified proteins
表1 rIsdB作为包被抗原时各组小鼠血清特异性抗体滴度的效价值Tab.1 Values of antibody titer in supernatant of mice in various groups when rIsdB being regarded as coating antigen(n=10,)
表1 rIsdB作为包被抗原时各组小鼠血清特异性抗体滴度的效价值Tab.1 Values of antibody titer in supernatant of mice in various groups when rIsdB being regarded as coating antigen(n=10,)
*P<0.01 vs rIsdB+adjuvant group.
Group Value of antibody 11 20 rIsdB+adjuvant 1760±876 titer(t/d)7680±2861 HBc-IsdB50-285+adjuvant 400±129* 2240±876*HBc-IsdB50-285 320±109* 1600±979*PBS 0* 0*
表2 HBc-IsdB50-285作为包被抗原时各组小鼠血清特异性抗体滴度的效价值Tab.2 Values of antibody titer in supernatant of mice in various groups when HBc-IsdB50-285being regarded as coating antigen (n=10,)
表2 HBc-IsdB50-285作为包被抗原时各组小鼠血清特异性抗体滴度的效价值Tab.2 Values of antibody titer in supernatant of mice in various groups when HBc-IsdB50-285being regarded as coating antigen (n=10,)
*P<0.05 vs rIsdB+adjuvant group;△P<0.05 vs HBc-IsdB50-285+adjuvant group.
Group Value of antibodytiter(t/d) 11 20 rIsdB+adjuvant 640±219 3200±1960 HBc-IsdB50-285+adjuvant 2720±2234*17920±7011 HBc-IsdB50-285 1920±1213*7040±3505*△PBS 0*△ 0*△
2.4 各组小鼠攻毒实验 各组小鼠在初次免疫后21d的攻毒实验:HBc-IsdB50-285添加佐剂组小鼠对金黄色葡萄球菌免疫保护率(60%)低于rIsdB添加佐剂组(70%),但差异无统计学意义(P>0.05)。HBc-IsdB50-285添加佐剂组小鼠对金黄色葡萄球菌免疫保护率与 HBc-IsdB50-285未添加佐剂组(40%)比较差异无统计学意义(P>0.05);与PBS组(0%)比较,HBc-IsdB50-285添加佐剂组小鼠对金黄色葡萄球菌攻毒保护率升高(P<0.01),HBc-IsdB50-285未添加佐剂组小鼠对金黄色葡萄球菌攻毒保护率亦升高(P<0.01)。见图5。
图5 金黄色葡萄球菌攻毒后各组小鼠生存曲线Fig.5 Survival curves of mice after S.aureus challenge in various groups
随着耐药性金黄色葡萄球菌在感染性疾病中比例的不断攀升及抗生素使用不当,使金黄色葡萄球菌感染的治疗面临巨大困难。科学家们试图通过使用疫苗疗法预防金黄色葡萄球菌感染,根据临床分离株所提供的相关信息,设计出了与金黄色葡萄球菌相关的多糖蛋白结合疫苗、蛋白亚单位疫苗和核酸疫苗等,但与金黄色葡萄球菌疫苗有关的临床试验均未成功[12],这一结果对疫苗的设计及抗原的选择提出了更苛刻的要求。
IsdB与金黄色葡萄球菌铁代谢相关,在多种类金黄色葡萄球菌中高度保守,最早应用于疫苗抗原是因为IsdB能够与受感染者血清发生高度特异性结合[13]。利用IsdB免疫能提高小鼠对金黄色葡萄球菌攻毒的存活率,由90μg IsdB联合铝佐剂制备的人用金黄色葡萄球菌疫苗在进行到Ⅱ期临床试验时未获成功,具体原因尚不清楚[14]。本文作者尝试改进抗原结构,使用IsdB表位(含部分氨基酸序列)结合到HBc免疫显性区。HBc载体本身具有辅助性淋巴细胞(Th)表位,其可以帮助提高体液免疫应答效果,同时HBc能够将外源表位展示于其所形成的蛋白颗粒的表面,利于抗原在细胞内的加工呈递[15]。HBc能够携带外源片段最小可以是15氨基酸的B细胞线性表位,最大也可以达到258氨基酸的绿色荧光蛋白片段,超出这一范围会影响HBc的组装及免疫原性[16]。采用分子生物学技术将HBc与IsdB50-285基因融合并在大肠杆菌中表达,在目的蛋白的C末端引入组氨酸标签,大大提高了蛋白的纯化效率,尽管可以出现抗组氨酸标签的抗体,但是对总体的免疫效果影响有限,如果免疫效果较好,可以进一步通过实验去掉纯化标签[17]。本研究采用弗氏佐剂提高免疫效果,下一步实验可以更换人体常用的铝佐剂来进行体内实验。本研究选择rIsdB作为阳性对照,其与HBc-IsdB50-285免疫保护效果比较差异无统计学意义,但是两者与阴性对照比较差异有统计学意义,表明 HBc-IsdB50-285结合佐剂使用具有良好的免疫原性。本研究所制备的融合蛋白对小鼠的免疫保护效果尽管未达到100%,但也为HBc载体在金黄色葡萄球菌疫苗中的应用提供了参考,本课题组可以进一步从金黄色葡萄球菌其他抗原中选取适合的抗原表位与IsdB表位联合使用,制备含有多种抗原表位的联合疫苗,进而提高免疫保护效果。
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