高效液相色谱法鉴别原料乳中碳水化合物掺伪

郑向华，杨自洁，张青燕，龚吉军，，，*，肖莲荣，邓放明

（1.厦门出入境检验检疫局科学研究院，福建厦门361026；2.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南长沙410004；3.湖南亚华乳业有限公司，湖南长沙410013；4.湖南农业大学生物学博士后流动站，湖南长沙410128）

高效液相色谱法鉴别原料乳中碳水化合物掺伪

郑向华1，杨自洁2，张青燕3，龚吉军2，3，4，*，肖莲荣3，邓放明4

（1.厦门出入境检验检疫局科学研究院，福建厦门361026；2.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南长沙410004；3.湖南亚华乳业有限公司，湖南长沙410013；4.湖南农业大学生物学博士后流动站，湖南长沙410128）

以Hypersil氨基柱为分离柱，乙腈-水（80∶20）为流动相，流速为1.0 mL/min，建立了用于同时鉴别原料乳中果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖掺伪的高效液相色谱法。结果表明，在0.5 mg/mL～20 mg/mL的范围内，线性关系良好，用于果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖掺伪鉴别的精密度分别为2.100%、1.500%、1.680%和2.975%，回收率分别为101.0%、100.0%、99.3%、99.3%，检出限分别0.21、0.25、0.22、0.20 mg/mL。此法准确可靠，可用于原料乳中此4种碳水化合物的掺伪检测。

原料乳；碳水化合物；掺伪检测；高效液相色谱法

原料乳中的碳水化物主要是乳糖。在原料乳生产过程中，为了使相对密度达到国标要求，在其中违规添加其他碳水化合物的现象时有发生。因此，建立快速且能同时鉴别原料乳中多种碳水化合物掺伪的技术手段，是现实的需求。

有关乳制品中碳水化合物检测方法的研究报道很多，如比色法［1］、荧光法［2］、色谱法［3-4］等，这些方法中，化学分析方法一般只能检测单一碳水化合物组分，而高效液相色谱法［5］具有步骤简单、可同时测定多种组分、结果准确的优点，近年来被广泛用于碳水化合物组分的分析。然而，高效液相色谱法目前主要用于乳制品或其他食品中正常碳水化合物成分的分析检测［6-8］，非掺伪检测，而将高效液相色谱法用于原料乳中碳水化合物的掺伪检测，还未见报道。本文旨在探明高效液相色谱-示差检测器法用于同时鉴别原料乳中果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖掺伪的技术方法，以期为生产实践中原料乳碳水化合物的掺伪鉴别提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂

色谱纯果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖Sigma公司；色谱纯乙腈Fisher公司；分析纯亚铁氰化钾、乙酸锌国药集团化学试剂有限公司；原料乳、乳清粉湖南亚华乳业有限公司提供。

1.1.2主要设备

Waters 2965高效液相色谱仪（RID检测器）：沃特世科技（上海）有限公司；AR2140电子分析天平：上海力衡仪器仪表有限公司；WH-2微型漩涡混合仪：上海沪西分析仪器厂有限公司；SB25-12DTD超声波清洗机：宁波新芝生物科技有限公司；DKB-501A超级恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；MilliPure A10纯水机：美国密理博公司；TDL-80-2B离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.2方法

1.2.1标准溶液的制备

1.2.1.1标准储备液的制备

精确称取果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖标准品各2.000 0 g，放入同一个100 mL容量瓶中完全溶解，超声处理10 min后，用超纯水定容，配制成20 mg/mL的混合标准储备液。置于4℃冰箱中保存。

1.2.1.2标准工作溶液的制备

分别吸取混合标准储备液，用超纯水定容于10 mL容量瓶中，依次稀释成浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/mL的标准工作液。

1.2.2色谱条件

色谱柱：Hypersil氨基柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈∶水（体积比）80∶20；流速：1.0 mL/min；柱温：室温；进样量：20 μL；运行时间：20 min。

1.2.3色谱峰保留时间的确定

准确称取果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖标准品各0.100 0 g，分别溶于4个100 mL容量瓶中，在1.2.2的色谱条件下检测，记录各标准品的保留时间，并与混标色谱图比较，根据保留时间确定各色谱峰的成分。

1.2.4样品的制备及前处理

1.2.4.1未加标样品溶液的配制及前处理

取10 mL原料乳，加适量超纯水，再加入2 mL亚铁氰化钾（150 g/L）、2 mL乙酸锌（300 g/L），充分反应后，用超纯水定容至100 mL，静止片刻，分别经滤纸和0.45 μm滤膜过滤，滤液备用。

1.2.4.2加标样品溶液的配制及前处理

取10 mL原料乳，按10.00 mg/mL的量加入果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖，加入少量50℃～60℃超纯水使其充分溶解，置于漩涡混合仪上充分混匀，超声处理10 min，分别加入2 mL亚铁氰化钾、2 mL乙酸锌。后续处理同1.2.4.1。

1.2.4.3乳清粉溶液的配制及前处理

称取0.100 0 g乳清粉，加入少量50℃～60℃超纯水使其充分溶解，于漩涡混合仪上充分混匀，超声处理10 min后，分别加入1 mL亚铁氰化钾和1 mL乙酸锌。后续处理同1.2.4.1。

1.2.4.4掺乳清粉原料乳样品的配制及前处理

在10 mL原料乳中，分别加入0.2、0.5 g和0.6 g乳清粉得到1、2和3号样品，加入少量50℃～60℃超纯水使其充分溶解。后续处理同1.2.4.1。

2结果与分析

2.1色谱条件的优化

2.1.1色谱柱的选择

碳水化合物分离和测定常用的色谱柱主要有两种：一种是阳离子交换柱或凝胶柱，以水、稀酸或醋酸钙溶液等作为流动相［9-10］；另一种是使用化学键合固定相，也就是氨基色谱柱，乙腈-水被作为流动相［11］。由于本文检测的果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖分子量较小，且结构简单，而氨基柱对流动相和柱温要求较低，价格也低于其它柱子，因此选择氨基柱来进行分离检测。

2.1.2流动相的选择

因检测目标物果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖含有极性基团，故选用极性较大的溶剂即乙腈作为流动相。流动相中，乙腈与水的配比对分离效果会产生直接影响。本文在预试验的基础上，设定了3种不同的乙腈与水配比，分别为80∶20、75∶25和70∶30（均为体积比），通过对比发现，乙腈与水的配比为80∶20时，果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖的分离效果相对较好。在此条件下，混合标准溶液中4种碳水化合物的分离情况见图1。

图1混合标准溶液Fig.1The chromatogram of mixed standard solution

图1的结果表明，该方法能够将4种碳水化合物完全分离。果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖的保留时间分别为7.476、8.358、11.590 min和15.032 min。在16 min内，可同时完成对4种掺伪碳水化合物的检测。

2.2标准曲线和检出限

以测得的峰面积（y）为纵坐标，以果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖含量（mg/mL）为横坐标，进行回归分析，得到线性回归方程和线性相关系数。结果见表1和图2～图5。

表1　4种碳水化合物的检出限和精密度Table 1The detection limit and precision of 4 carbohydrates

图2　果糖的标准曲线Fig.2The standard curve of fruit

图3　葡萄糖的标准曲线Fig.3The standard curve of glucose

图4　蔗糖的标准曲线Fig.4The standard curve of sucrose

图5　乳糖的标准曲线Fig.5The standard curve of lactose

在0.5 mg/mL～20 mg/mL的范围内，4种碳水化合物的线性相关系数R2为0.999 0～0.999 4，其相关性很好。本文的检测范围比李静芳等［5］的研究有所扩大，但所得回归方程的线性相关性并未降低。相对标准偏差（RSD）均在3%以内，说明本文所建方法的精密度高；以3倍信噪比（S/N）计算检出限，4种碳水化合物的检出限在0.25 mg/mL以内。

2.3回收率试验

回收率试验结果见表2。

表2　回收试验结果Table 2Results of recovery test

表2的结果表明，原料乳样品中乳糖含量为4.56 mg/mL，即为加标回收率试验时乳糖的本底值。果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖的回收率分别为101.0%、100.0%、99.3%和99.3%，结果非常理想，说明本文所建方法用于原料乳中碳水化合物掺伪鉴别是可靠的。

2.4乳清粉掺伪原料乳的检测

正常牛生乳的乳糖含量一般为4.4%～5.2%，为了使乳糖含量偏低的原料乳符合乳糖含量要求，掺入乳清粉是比较常见的方式。为了能获得用于生产实践的乳清粉掺伪检测方法，在采用标准品试验的基础上，本文将所建方法在乳清粉掺伪检测上作进一步验证。乳清粉和乳清粉掺伪原料乳检测色谱图见图6和图7，验证试验结果见表3。

由图6可见，所采用的乳清粉中只有1种碳水化合物，即乳糖，且乳清粉中的其他成分对乳糖检测结果没有影响。说明本文建立的高效液相色谱法适用于乳清粉中乳糖的检测。

由图7可见，原料乳中以乳清粉形式掺入乳糖后，样品中乳糖的分离检测色谱图中没有出现干扰峰，说明本文建立的方法适用于以乳清粉形式的乳糖掺伪检测。

图6　乳清粉检测色谱图Fig.6Chromatogram of whey powder

图7　乳清粉掺伪样品检测色谱图Fig.7Chromatogram of raw milk adulterated with whey powder

表3　乳清粉及乳糖掺伪原料乳样品测定结果Table 3Results of whey powder and raw milk adulterated with whey powder

由表3的结果可以看出，本文所用乳清粉中乳糖含量为72.92%，样品1～3中乳糖含量明显高出正常原料乳中乳糖含量，可以判定该原料乳样品存在乳糖掺伪。同时，本文所建方法用于原料乳中乳清粉掺伪检测的误差很小，说明该方法可靠。

3结论

以氨基柱为分离柱，乙腈-水（80∶20）为流动相，建立了高效液相色谱-示差检测法用于原料乳中果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖的掺伪鉴别。该法可对上述4种碳水化合物同时进行定量掺伪检测，其前处理简单，分离时间短（在16 min内完成）。在0.5mg/mL～20 mg/mL范围内，4种碳水化合物的线性关系好，检出限低，回收率高，误差小，说明本文所建方法可靠。

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Identify the Carbohydrate Adulteration in Raw Milk by High Performance Liquid Chromatography

ZHENG Xiang-hua1，YANG Zi-jie2，ZHANG Qing-yan3，GONG Ji-jun2，3，4，*，XIAO Lian-rong3，DENG Fang-ming4
（1.Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen 361026，Fujian，China；2.College of Food Science and Engineering，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，Hunan，China；3.Hunan AWA Dairy Co.，Ltd.，Changsha 410013，Hunan，China；4.Post-doctoral Mobile Station of Biology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China）

Taken Hypersil amino column as the separation column，CH3CN/H2O（80∶20，v/v）as the mobile phase，and the flow rate kept at 1.0 mL/min，a method of high performance liquid chromatography monitored by refractive index dectetor was established for the adulteration detection of fructose，glucose，sucrose，and lactose in raw milk.The linear relationship of these four regression equations obtained in this study was very good in a range of 0.5 mg/mL-20 mg/mL；the relative standard deviation was 2.100%，1.500%，1.680%，and 2.975%，respectively；the average recovery rate was 101.0%，100.0%，99.3%，and 99.3%，respectively；the detection limit was 0.21，0.25，0.22，and 0.20 mg/mL，respectively.It might be concluded that this method wasan accurate and raliable one for the adulteration detection of four carbohydratesabove-mentioned in raw milk.

raw milk；carbohydrates；adulteration detection；high performance liquid chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.10.020

2014-10-16

国家十二五科技支撑计划课题“原料奶质量安全监控关键技术研究”（2012BAD12B04）；国家质检总局科技计划项目“原料乳碳水化合物掺伪鉴别技术研究”（2013IK186）；湖南省高校科技成果产业化培育项目（12CY009）；中南林业科技大学“十二五”专业综合改革试点项目（2013-6）

郑向华（1976—），女（汉），高级工程师，硕士，研究方向：食品质量与安全。

龚吉军（1972—），男（汉），教授，博士，研究方向：食品质量与安全，天然食品保鲜剂开发与利用。