基于DNA酶催化增敏的微流控顺序注射化学发光法检测钾离子的研究

宋丽芳， 王 征， 邬期望， 沈 宏*

(1.浙江大学化学系，浙江杭州 310058； 2.解放军杭州疗养院，浙江杭州 310007)

水体含有丰富的K+，是人体摄取K+的重要来源。K+是一种重要的生理元素， 在平衡细胞渗透压，调节体内其他离子浓度方面起着重要作用[1]。体内K+浓度失衡与心律失常、高血压、肾功能障碍等疾病都有一定的关联。所以建立高灵敏、高特异性的测定生物体及环境水体中K+的分析方法非常重要。

生物体内的基因组中含有大量G -四联体结构，主要分布在启动子区和端粒区，可以调控基因表达、降低端粒酶活性、稳定染色体末端结构，并与多种癌症疾病相关[2，3]；在体外，一些富含鸟嘌呤的寡核苷酸链可在K+的参与下形成四联体分子，若进一步结合血红素，则转化为具有类辣根过氧化物酶活性的DNA酶，催化H2O2的氧化反应[4 - 6]。近年来，基于K+对G -四联体分子形成的稳定作用，进行K+分析的新方法备受关注[7]，常见的有荧光法[4]和分光光度法[5]。荧光法灵敏度较高[8]，但受荧光基团性质的制约，常需在非水介质中进行，且标记反应较费时，标记物较昂贵。分光光度法操作简便，一般通过催化氧化2，2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)或3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)等显色剂实现定量分析，但存在ABTS的氧化产物不稳定、易褪色，TMB的显色较慢(大于10 min)等缺点[9]。另外，基于DNA酶催化鲁米诺-H2O2的化学发光检测法也有报道[10]，该法虽然具有灵敏度高、仪器简单的优点，但试样、试剂消耗量大(一般大于12 pmol DNA/次)[10]。

本文采用基于微流控技术的顺序注射化学发光方法，以双螺旋通道微芯片作为发光试剂和DNA酶的在线混合池和信号采集区，建立了一种简单、快速检测K+的方法，试剂消耗量少(1 pmol DNA/次)，检测通量高(60 h-1)。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UV2200PC(上海舜宇恒平科学仪器)；K640型热循环仪(杭州晶格科学仪器)；PHD -2000微量注射泵(美国，哈佛仪器公司)；WFX-120B原子吸收分光光度仪(北京瑞利分析仪器公司)；自制微顺序注射化学发光分析仪，包括光电倍增管(PMT)(日本滨松电子)，带有三通阀的顺序注射泵(SP)和六通阀(SV)(美国科龙公司)，双螺旋微流控玻璃芯片[11](50 μm深，300 μm宽)，数据采集处理系统(Data Card)(杭州扬程科技有限公司)。

寡核苷酸PS5. M (5′-GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG -3′)，PS2. M (5′-GTGGGTAGGGCGGGTTGG -3′) 购于英潍捷基上海贸易有限公司。鲁米诺购于美国Fluka公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)，氯化血红素(Hemin)，二甲基亚砜(DMSO)，Triton X-100，H2O2，KCl，MgCl2，NH4Cl，LiCl，NaCl，CaCl2均为分析纯，购于上海国药集团。寡核苷酸用pH=8.0的10 mmol·L-1Tris -HCl缓冲液配成100 μmol·L-1的储备液，-20 ℃储存。血红素溶于DMSO，配成500 μmol·L-1储备液，使用前根据需要稀释。反应缓冲液由25 mmol·L-1Tris -HCl，0.025% Triton X-100，1% DMSO组成(pH=9.0)。

图1 实验装置示意图Fig.1 Schematic diagram of sequential injection microfluidic chemiluminescence systemPump:PHD -2000 micropump;PMT:photo multiplier tube;SP:syringe pump;SV:six-port multiposition valve.

1.2 孵育DNA酶

1.5 μmol·L-1的寡核苷酸溶液于温度90 ℃加热5 min，缓慢冷却至室温。然后加入等体积不同浓度的KCl，室温孵育1 h；再向溶液中加入等体积的1.5 μmol·L-1血红素，室温孵育30 min。

1.3 实验方法

实验装置如图1所示。通过PHD -2000微量注射泵以150 μL·min-1的速度将0.5 mmol·L-1的鲁米诺和0.7 mol·L-1H2O2分别从微流控芯片的1、2口推入，待基线平稳后，SV先转到C口吸取18 μL反应缓冲液，再转到D口吸取2 μL DNA酶试样溶液，然后转到A口，将20 μL溶液通过3口注入，在第二个螺旋通道内与鲁米诺-H2O2发光试剂反应并由PMT检测。除第二个螺旋通道外，其余非检测区域均用黑胶带覆盖；整个微芯片置于暗盒中。重复上述过程检测E、F处不同试样DNA酶溶液。

2 结果与讨论

2.1 实验原理

常温下，富含鸟嘌呤的寡核苷酸PS5. M以自由无序状态存在溶液中；加入K+后，PS5. M的构象发生变化，以Hoogsteen碱基配对方式形成G -四分体平面，继而堆积成G -四联体；而G -四联体与血红素有较高的亲合力，相互结合后形成DNA酶。DNA酶具有类辣根过氧化物酶活性，可以催化H2O2氧化鲁米诺(图2)。实验表明，DNA酶的催化活性与K+浓度相关，即化学发光信号可随K+浓度增大而增强。而当溶液中无K+加入时，自由无序状态的PS5. M无法有效地与血红素亲合，仅产生微弱的化学发光。据此，可以根据化学发光的强度定量测定K+。

图2 DNA酶增敏化学发光法分析测定K+示意图Fig.2 Schematic diagram of chemiluminescence(CL) determination of K+ enhanced by K+-induced DNAzyme

图3 血红素与寡核苷酸发生亲合作用前后的紫外-可见吸收光谱Fig.3 UV-Vis absorption spectra of hemin -oligonucleotide interactions in the absence or presence of K+Hemin:0.5 μmol·L-1;PS5. M:0.5 μmol·L-1;PS2. M:0.5 μmol·L-1;K+:400 μmol·L-1.

2.2 DNA酶的表征和催化活性

血红素分子内的卟啉环在400 nm 波长附近具有较强的B带紫外-可见吸收，称为Soret 带；当血红素与G -四联体分子亲合后，该Soret带的最大吸收峰会发生增色和红移的现象[12,13]。为研究PS5. M与血红素的亲合效应，实验比较了血红素与PS5. M亲合前后的吸收光谱图，并进一步以PS2. M为参照物，对照比较了血红素与PS2. M结合前后的吸收光谱。由图3可见，血红素的特征吸收波长为398 nm(曲线a);在K+参与下，血红素与PS5. M的亲合效应显现，最大吸收波长红移到404 nm，且吸收峰强度明显增强(曲线e)。这与文献报道的G -四联体与血红素亲合作用结果一致[12,13]，说明K+可促进PS5. M形成G -四联体，并与血红素结合形成DNA酶。而在相同的条件下，PS2. M与血红素结合后引起的增色效应明显较弱(曲线d)。因此，推测PS2. M形成的G -四联体与血红素的亲合作用小于PS5. M。另外，当溶液中无K+时，血红素与PS2. M以及PS5. M的亲合作用均不能引起Soret带的明显变化(曲线b、c)。证明K+不存在时，PS5. M和PS2. M均难以形成G -四联体，自由无序状态的寡核苷酸链也难以与血红素亲合。

为考察PS5. M形成的DNA酶的活性，并与PS2. M形成的DNA酶比较，实验中将上述两种酶(均为0.5 μmol·L-1)，分别用于催化鲁米诺(0.5 mmol·L-1)-H2O2(0.7 mol·L-1)发光反应。结果显示，PS5. M形成的DNA酶催化增敏效应几乎是PS2. M形成的DNA酶的增敏效应的一倍。表明K+诱导PS5.M形成的DNA酶具有更高的催化活性。

2.3 实验条件优化

由于G -四联体与血红素的亲合反应条件与DNA酶的形成密切相关，且化学发光反应条件对于提高检测的灵敏度有较大影响。因此，实验有针对性地优化了G -四联体与血红素亲合反应的条件，以及DNA酶催化化学发光反应的条件。

2.3.1温度对DNA酶形成的影响考察了4～60 ℃温度范围内，不同的孵育温度对G -四联体和血红素亲合作用的影响。从图4可以看出，孵育温度从4 ℃升高至25 ℃，DNA酶的催化增敏效应增强；但继续升高温度，化学发光强度却逐渐下降；这可能与G -四联体结构的稳定性有关。因为在过高温度下，通过Hoogsteen碱基配对的G -四联体分子，会出现氢键打开呈自由无序单链的现象。因此，提高温度虽有利于亲合反应的较快进行，但同时控制较适当的温度也与保持G -四联体分子的稳定密切相关。实验中最终选择25 ℃作为G -四联体/血红素亲合反应的孵育温度。

2.3.2反应时间对DNA酶形成的影响考察了10～90 min 范围内，G -四联体与血红素亲合反应时间对DNA酶形成活性的影响。结果表明，反应时间从10 min 延长至30 min，DNA酶催化增敏效应有明显增加，但反应时间达30 min后，化学发光强度则趋于稳定。因此，最终选择30 min 为G -四联体与血红素亲合反应的时间。

2.3.3发光试剂浓度对催化发光的影响根据文献报道[13]，在DNA酶催化氧化反应中，发光底物浓度对信号的影响远比氧化剂(H2O2)浓度的影响小。本实验也证实了这一结论，即控制H2O2浓度在0.3 mol·L-1，鲁米诺浓度从0.25 mmol·L-1升高至1 mmol·L-1，DNA酶催化发光强度变化不明显；反之，若控制鲁米诺浓度为0.5 mmol·L-1，考察H2O2浓度从0.1 mol·L-1升高至0.7 mol·L-1，化学发光显著增强(图5)；而当H2O2浓度大于0.7 mol·L-1后，发光又逐渐减弱。因此，最终选择0.5 mmol·L-1鲁米诺，0.7 mol·L-1H2O2作为发光试剂的浓度条件。

2.3.4试剂流速对催化发光的影响实验考察了试剂(鲁米诺和H2O2)流速对发光信号的影响。结果表明，当流速从30 μL·min-1开始升高时，化学发光强度随流速增大而增强，并在150 μL·min-1时发光强度最大；继续增大流速至180 μL·min-1，发光强度又降低。因此，试剂流速选择150 μL·min-1。实验结果表明DNA酶催化的鲁米诺-H2O2发光反应速度较快。

2.4 方法的选择性

图4 温度对G -四联体与血红素结合形成DNA酶的影响Fig.4 Effect of temperature on formation of DNAzyme by G -quadruplex and heminPS5. M:0.5 μmol·L-1;K+:100 μmol·L-1;Hemin:0.5 μmol·L-1;H2O2:0.7 mol·L-1;Luminol:0.5 mmol·L-1.

图5 H2O2浓度对化学发光的影响Fig.5 Effect of concentration of H2O2 on chemiluminescencePS5. M:0.5 μmol·L-1;K+:100 μmol·L-1;Hemin:0.5 μmol·L-1;Luminol:0.5 mmol·L-1.

2.5 线性范围、检出限和精密度

在优化的实验条件下，K+在1.0～700 μmol·L-1范围内与化学发光强度线性相关，线性回归方程为：△I=1.988c(μmol·L-1)+20.086(△I为扣除空白信号的化学发光强度)，相关系数为0.991，其检出限(S/N=3)为0.54 μmol·L-1。同时，对100 μmol·L-1的K+形成的DNA酶平行测定10次，相对标准偏差(RSD)为1.61%。发光检测通量为60 h-1。

2.6 实际水样分析

取浙江大学启真湖不同湖段的湖水，用0.22 μm的混合纤维素微孔滤膜过滤，水样稀释一倍，按照实验方法孵育DNA酶并分析K+含量,并与原子吸收法(AAS)结果对照。结果如表1所示，可见分析结果与原子吸收测定结果基本一致，进一步用加入回收法检验方法准确性，回收率93.3%～108.6%。表明本方法可用于实际水样中K+的分析。

表1 水样中K+的分析结果

3 结论

本研究利用K+促进DNA酶形成，进而催化鲁米诺-H2O2化学发光反应的原理，建立了微流控顺序注射化学发光联用检测K+的新方法。该方法仪器装置简单，试剂消耗大幅度减小，检测连续、快速。对真实水样中K+的测定结果与火焰原子吸收测定结果相符，加标回收率为93.3%～108.6%。建立的方法对检测K+具有高选择性，有望应用于环境样品和生物样品中K+的测定。