高效液相色谱法测定有机肥中洛克沙胂

奚功芳, 周守标， 姚春霞

(1.上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所，上海 201403； 2.安徽师范大学环境科学与工程学院，安徽芜湖 241003)

洛克沙胂(Roxarsone，ROX)化学名称是3-硝基-4-羟基苯胂酸，因其能够促进动物血液循环，刺激生长，并具有一定的抗菌、抗寄生虫等药理作用，作为饲料添加剂而被畜禽养殖业广泛应用[1]。但畜禽对洛克沙胂的吸收很少，大部分未经转化即经粪尿排出体外[2]。洛克沙胂虽然本身并没有毒性，但随着堆肥或者灌溉的形式进入环境之后，经降解转化可转变成其他形态，毒性加强[3，4]，可对生态环境造成较大影响并且通过食物链对人体健康造成危害。研究表明[5，6]，猪场周边环境中砷含量明显高于其他地区，这与利用含洛克沙胂的有机肥密切相关。畜禽粪便是洛克沙胂进入环境的主要媒介[7]，为有效控制环境中砷含量，因此，建立有机肥中洛克沙胂的检测方法具有重要意义。

目前，洛克沙胂的检测方法主要有液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱法(LC-HG-AFS)[8]、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICP-MS)[9]、毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱法(CE-ICP-MS)[10]、离子色谱-电感耦合等离子体质谱法(IC-ICP-MS)[11]及高效液相色谱法(HPLC)[12]等。上述方法多为测定饲料或饲料添加剂中洛克沙砷的含量,用HPLC法检测有机肥中洛克沙砷含量的报道则较少。本文选用高效液相色谱建立检测有机肥中洛克沙胂的分析方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器、试剂和材料

Waters 2690型高效液相色谱仪(美国，Waters 公司)，Waters 2487紫外检测器；MAX固相萃取小柱(60 mg/3mL，北京市广谱达科技有限公司 )；HGC-24A氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司)。

洛克沙胂标准品(99.0%，北京北纳创联生物技术研究院)储备液：准确称取10.10 mg洛克沙胂标准品于100 mL棕色容量瓶中，加适量甲醇超声助溶后定容，配制成100 mg·L-1的洛克沙胂标准储备液，于4 ℃冰箱保存备用。洛克沙胂工作液：准确吸取100 mg·L-1的洛克沙胂的标准储备液1 mL于10 mL棕色容量瓶中，甲醇定容，配成10 mg·L-1的洛克沙胂工作液，于4 ℃冰箱保存备用。甲醇(色谱级)；K2HPO4(分析纯)；NaH2PO4(分析纯)，甲酸(分析纯)，H3PO4(分析纯)，CuSO4(分析纯)，氨水(分析纯)，乙酸钠(分析纯)，乙酸(分析纯)，超纯水。

有机肥样品采集于上海市养殖场，于-20 ℃贮存，临用前解冻干燥，粉粹后过100目筛，洛克沙胂的背景值为零。

1.2 色谱条件

色谱柱：Symmetry ShieldTMRP 18柱(150×4.6 mm,3.5 μm,美国Waters)；流动相：含0.1%甲酸的0.05 mol·L-1KH2PO4∶甲醇=95∶5(V/V)，等度洗脱；流速：1.0 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：20 μL；紫外检测波长：266 nm。流动相：按含0.1%甲酸(V/V)的0.05 mol·L-1KH2PO4∶甲醇=95∶5(V/V)比例配制，混匀后用0.45 μm的微孔滤膜过滤，然后超声脱气15 min，现配现用。淋洗液：0.05 mol·L-1乙酸钠∶甲醇=95∶5(V/V)，用1%的乙酸将其pH调至7。洗脱液：甲酸∶甲醇=8∶92(V/V)。

1.3 样品处理

1.3.1提取准确称取有机肥样品0.5 g于50 mL的聚丙烯离心管中，添加一定量已知浓度的洛克沙胂溶液于其中，混匀，置于4 ℃冰箱中静置1 h后，加入提取剂10 mL，涡旋2 min，于温度60 ℃下超声提取30 min，在4 500 r·min-1下离心10 min，转移上清液于另一50 mL离心管中。残渣再加入10 mL提取剂重复上述操作2次，合并上清液，加入2 mL 100 g·L-1CuSO4沉淀蛋白，静置30 min，然后于4 500 r·min-1下离心10 min，转移上清液于另一离心管中，用10%的氨水将提取液的pH调至6～7，取3 mL提取液上固相萃取小柱净化。

1.3.2样品净化先用3 mL甲醇和3 mL超纯水活化固相萃取小柱。活化后，取提取液3 mL上净化小柱，再先后用3 mL淋洗液和甲醇冲洗小柱，淋洗后再用5 mL洗脱液以1.0 mL·min-1的流速洗脱洛克沙胂，收集洗脱液并于40 ℃下氮气吹干，用1 mL超纯水涡旋并超声溶解，经0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液供HPLC检测。

2 结果与讨论

2.1 提取剂和提取方式的选择

根据文献报道[7,9],本实验比较了0.1 mol·L-1NaH2PO4-H3PO4(9∶1,V/V)、0.1 mol·L-1H3PO4及20 g·L-1K2HPO4三种提取剂，以及振荡和超声两种方式下提取有机肥中洛克沙胂。结果发现三种提取剂在不同提取方式下对有机肥中洛克沙胂的提取率都很高。其中，在超声条件下洛克沙胂的回收率要高于振荡提取方式，并且在超声提取方式下选用20 g·L-1K2HPO4作提取剂时，洛克沙胂的加标回收率最高，达86.80%，相对偏差为1.63%，且提取剂比黄连喜等[13]使用的提取剂简单，易于操作，故本实验选择20 g·L-1的K2HPO4作为提取剂在超声条件下提取有机肥中的洛克沙胂。另外，由于有机肥中杂质成分较多，含有大量的蛋白质，这些都会对洛克沙胂的的出峰时间及峰形产生一定的干扰，因此，本实验采用100 g·L-1的CuSO4来沉淀有机肥中的蛋白质，去除杂质。同时，因对样品三次重复提取，进一步保证了有机肥料洛克沙胂的提取效率。

2.2 净化条件的优化

根据固相萃取吸附机理，洛克沙胂的pKa为3.9，故提取液在上小柱前需用1%氨水将pH调至6～7之间。肖亚兵等[14]比较了不同固相萃取小样对样品的净化效果，发现MAX小柱最好，回收率高达 97% 以上，因此本实验采用MAX固相萃取小柱对样品进行净化，并调节提取液pH至6～7。根据MAX固相萃取柱的特点，选择0.05 mol·L-1乙酸钠∶甲醇=95∶5(V/V，pH=7)和纯甲醇作为淋洗液，采用甲酸∶甲醇=8∶92(V/V)作为洗脱液。根据王金荣等[16]提出的增加甲酸在洗脱液中的比例可以提高洗脱回收率，本实验比较了不同比例的甲酸∶甲醇，发现甲酸为8%时，洗脱回收率最高，因此洗脱液采用甲酸∶甲醇=8∶92(V/V)。

2.3 流动相的选择

根据相关研究[15]，本实验以甲醇作为有机改良剂，比较了100%的0.1%的三氟乙酸 、0.1%的三氟乙酸∶甲醇=95∶5(V/V)、含0.1%甲酸的0.05 mol·L-1KH2PO4∶甲醇=95∶5(V/V)及含0.1%甲酸的0.05 mol·L-1KH2PO4∶甲醇=90∶10(V/V)四种流动相，结果发现，当用磷酸盐做流动相时有助于改善洛克沙胂的峰形，并且当流动相中加入甲醇时，有助于缩短洛克沙胂的保留时间，当流动相中甲醇的比例为5%时，洛克沙胂的出峰时间在6 min左右，并且避开了试剂峰的干扰。故本实验最终选择含0.1%甲酸的0.05 mol·L-1KH2PO4∶甲醇=95∶5(V/V)作为流动相。

2.4 标准曲线与检出限

将不同浓度梯度的洛克沙胂标准溶液进行HPLC分析，每个浓度重复测定5次。以进样浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，洛克沙胂在0.05～10.0 mg·L-1范围检测的线性关系良好，线性相关系数达0.999，取信噪比(S/N)≥3时的浓度为检出限,洛克沙胂的检出限为20 μg·L-1。检出限远远低于白亚楠等人[16]利用HPLC法检测鸡粪便中洛克沙胂的检出限170 μg·L-1。

2.5 精密度及回收率实验

2.5.1精密度实验准确称取0.5 g空白有机肥于50 mL离心管中，分别加入一定量已知浓度的洛克沙胂标准溶液，经1.3节处理后，最终进样浓度分别是6、3及1.5 mg·L-1，进行HPLC检测,每个浓度的样品同日内重复测定5次，重复5 d。根据标准曲线回归方程计算洛克沙胂的浓度及相对标准偏差，求出洛克沙胂的日内和日间变异系数。结果表明，方法的变异系数介于0.053%～2.04%之间，明显低于陈冬梅等人[17]的4.3%，洛克沙胂的日间和日内的变异系数较小，重现性好，精密度高，表明此方法适用于有机肥中洛克沙胂的检测。

2.5.2加标回收率准确称取0.5 g空白有机肥，分别加入一定量的已知浓度的洛克沙胂标准溶液。经1.3节处理后，最终样品中洛克沙胂进样浓度分别是6、3及1.5 mg·L-1。结果表明(表1)，肥料中洛克沙胂的回收率较高，各浓度的平均回收率的范围在81.14%～82.75%之间，相对标准偏差(RSD)在3.63%～7.04%范围，并且回收率高于曾婧等人[18]对利用HPLC法检测鸡排泄物中洛克沙胂的74.4%。说明此方法检测有机肥中洛克沙胂时回收率高并且重复性良好。

表1 有机肥中洛克沙胂的回收率(n=3)

2.6 实际样品分析

从某一长期使用洛克沙胂添加剂的养殖场采集有机肥样品2个，经风干，研碎过100目筛之后装于自封袋中待用。样品经前处理后，上机检测，该养殖场有机肥中洛克沙胂含量的平均值为9.89 mg·kg-1。

3 结论

本研究采用HPLC法测定有机肥中的洛克沙胂含量，选用组成简单的含0.1%甲酸的0.05 mol·L-1KH2PO4∶甲醇=95∶5(V/V)作为流动相，洛克沙胂的保留时间短，峰形良好，并且目标峰附近无杂质峰干扰。该方法精密度高，重现性好，线性范围宽，检出限低，适用于有机肥中洛克沙胂检测。