柱前衍生高效液相色谱-荧光检测/质谱联用测定沙棘种子中游离脂肪酸

胡 娜， 索有瑞， 韩丽娟， 索有芳， 王 宁， 尤进茂

(1.中国科学院西北高原生物研究所,青海西宁 810001；2.青海大学农林科学院,青海西宁 810016；3.青海省环境监测中心站，青海西宁 810007；4.中国科学院大学,北京100049)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)为胡颓子科(Elaeagnaceae)沙棘属(HippophaeL.)植物(SeaBuekthorn)，又叫醋柳、酸刺、黑刺，为灌木或小乔木[1]。沙棘的天然分布很广，在欧亚大陆温带地区均有分布。我国沙棘属植物资源丰富，而青海沙棘资源约占全国总沙棘总量的10%。沙棘除作为生态保护的先锋物种[2]，还具有祛痰、利肺、开胃、补脾、活血、祛瘀、消炎、止痛、促进组织再生等药理功能[3]，其维生素C含量之高是其他浆果和水果无法相比的[4]。在工业应用上，沙棘籽油、黄酮、花青素和维生素E等都是护肤美容活性成分[5]。其中，沙棘籽油是多种脂溶性维生素和皮脂活性物质的复合体，具有滋养皮肤，促进新陈代谢，抗过敏，杀菌消炎，促进上皮组织再生的功能作用[6]。

图1 BCETS的结构式Fig.1 The structure of BECTS

研究发现，脂肪酸尤其是不饱和脂肪酸具有重要的生理功能，对中枢神经系统和视网膜的生长和发育、心血管系统具有重要的作用，可以预防动脉粥样硬化、心脏病、抑郁症和癌症等疾病[7]。沙棘种子中脂肪酸成分的测定目前已有很多报道，但方法多数是采用气相色谱或者气相色谱-质谱联用技术。本研究以新型荧光衍生试剂2-(11-H-苯-a-咔唑)乙基对甲苯磺酸酯(BCETS)为柱前荧光衍生试剂(结构见图1)，利用高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)并与质谱(MS)联用对沙棘种子中的游离脂肪酸组成进行了研究，为进一步开发利用沙棘果实提供理论基础。

1 实验部分

1.1 仪器与条件

Agilent 1100液相色谱-离子阱质谱联用仪(美国，Agilent公司)，配备四元梯度泵、在线真空脱气机、荧光检测器和自动进样器，大气压化学电离源(APCI)。高效液相色谱系统软件：HP Chemstation software；质谱系统：Esquire-LC NT software；Hypersil BDS C8柱(200×4.6 mm,5 μm,Agilent Co.) ；流动相A:100%乙腈，流动相B:5%乙腈;洗脱梯度如下：0 min为65%A,35 min为83%A,50 min为88%A,55 min为100%A,60 min为100%A；流速1.0 mL/min，进样量10 μL，柱温35 ℃。荧光激发和发射波长分别为279 nm和380 nm。色谱峰按标准对照品保留时间定性，并通过在线质谱鉴定，质谱条件：大气压化学电离源(APCI)，正离子模式，喷雾压力60 psi，干燥气流量为5 L/min，干燥气温度350 ℃，Vap温度450 ℃，毛细管电压3 500 V，电晕电流4 000 μA(Pos)。

1.2 试剂与材料

脂肪酸标准品均购自Sigma公司；2-(11-H-苯-a-咔唑)乙基对甲苯磺酸酯(BCETS)由尤进茂教授课题组实验室合成；光谱纯乙腈购于Merck公司；N,N′-二甲基甲酰胺(DMF)(济宁化学试剂公司) 经减压蒸馏后使用；色谱纯乙腈(禹王试剂公司)；其他试剂均为分析纯。纯水由Milli-Q超纯水系统制备。

于2012年9月份在青海省循化县白庄镇苏乎沙村采集完全成熟的沙棘果实。分别选取附近4个不同的采样点进行采样，经中国科学院西北高原生物研究所周昌范工程师鉴定为沙棘(HippophaerhamnoidesL.)的果实。将榨完果汁剩下的果渣进行清洗，去除果皮，保留种子，并将洗干净的沙棘种子于60 ℃烘箱中烘至恒重。取20 g干燥好的沙棘种子，用高速万能粉碎机粉碎，过40目筛，备用。

1.3 实验方法

1.3.1标准溶液的配制与衍生稀释各标准品储备溶液(0.01 mol/L)得各低浓度标准品溶液。准确称取22.15 mg BCETS，用DMF定容至10 mL。标准品溶液衍生：向盛有15 mg无水K2CO3的2 mL安培瓶中依次加入30 μL标准品混合溶液，120 μL BCETS溶液，150 μL DMF，封口后于90 ℃恒温水浴下反应30 min。反应完毕，冷却，过0.22 μm滤膜后，待分析。

1.3.2脂肪酸供试液的制备与衍生精确称取约100.0 mg样品至10 mL具塞刻度试管中，加入5 mL石油醚，超声提取1 h，取100 μL用N2吹干后，加入100 μL的DMF和200 μL的衍生试剂，封口后于温度90 ℃恒温水浴下衍生30 min，然后加入250 μL乙腈稀释，过0.22 μm滤膜，放入冰箱备用。

2 结果与讨论

2.1 HPLC分离及MS鉴定

图2 标准脂肪酸衍生物的色谱分离图Fig.2 Chromatogram of fatty acid derivatives from 20 fatty acid standardsPeak labels:C10(decoic acid);C11(undecanoic acid);C12(dodecanoic acid);C13(tridecanoic acid);C18∶3(8,11,14-octadecatrienoic acid);C14(myristic acid);C16∶1(palmitoleic acid);C18∶2(9,12-octadecadienoic acid);C15(pentadecanoic acid);C16(hexadecanoic acid);C18∶1(12-octadecenoic acid);C17(heptadecanoic acid);C18(octadecanoic acid);C20∶1(11- eicosenoic acid);C19(nonadecanoic acid);C20(arachidic acid);C21(heneicosoic acid);C22(docosanoic acid);C23(tricosanoic acid);C24(tetracosanoic acid).

按上述实验条件，20种标准脂肪酸衍生物获得完全分离，代表谱图见图2。各组分经液相色谱分离荧光检测后，直接进入柱后串联质谱进行定性鉴定，20种脂肪酸的衍生物一级质谱数据见表1。代表性的BCETS-C18∶1脂肪酸的MS、MS/MS和裂解模式分析见图3。

2.2 方法学验证

优化条件下，对标准系列溶液平行6次进样测定，并建立标准曲线，各衍生物均表现出良好的线性，其相关系数(r)≥0.9995，线性范围是1.562～50 mmol/L。检测限(LOD)(S/N=3)在0.42～1.82 ng/mL之间，定量限(LOQ)(S/N=10)在1.34～6.64 ng/mL之间，证明该方法具有较高的灵敏度。将已知量的脂肪酸标准品加入样品，加标样品用于整个实验过程，包括提取、衍生和进样分析，实验重复三次。依据公式计算回收率，实验结果显示各脂肪酸的加标回收率在92.6%～101.9%范围内，相对标准偏差(RSD)在1.89%～4.91%之间，表明这种方法具有较好的准确度和精确度。实验结果列于表1。

2.3 沙棘种子中游离脂肪酸分析

按上述实验条件，对实际样品衍生后进行色谱分离及质谱鉴定，色谱分离见图4。由于所采四个样点中沙棘种子中脂肪酸含量相差不大，故仅以4个采样点种子中脂肪酸含量的平均值进行说明。由图4可知，

表1 脂肪酸衍生物的质谱数据、线性回归方程、相关系数、检出限、重现性与精确度

图3 油酸(C18∶1) 质谱图及其质谱裂解模式 Fig.3 MS and MS/MS spetrum of representative oleinic acid (C18∶1) derivative and the cleavage mode of protonated molecular ion

图4 沙棘种子种脂肪酸衍生物的色谱分离图Fig.4 Chromatogram of fatty acid derivatives from seeds of Hippophae rhamnoides L.

沙棘种子中主要含有的不饱和脂肪酸为亚油酸(C18∶2)，亚麻酸(C18∶1)和油酸(C18∶3)。另外还含有少量的棕榈油酸(C16∶1)。饱和脂肪酸主要以棕榈酸(C16)和硬脂酸(C18)为主，含有少量的十三酸(C13)、肉豆蔻酸(C14)、花生酸(C20)、山嵛酸(C22)和木蜡酸(C24)。沙棘种子中所含脂肪酸含量分别为：C13(49.0 μg/g),C18∶3(1060.5 μg/g),C14(26.6 μg/g),C16∶1(1060.5 μg/g),C18∶2(2325.3 μg/g),C16(528.6 μg/g),C18∶1(1959.1 μg/g),C18(277.3 μg/g),C20(188.3 μg/g),C22(27.4 μg/g),C24(32.5 μg/g)。由上述数据可知，总不饱和脂肪酸含量(6405.4 μg/g)远高于总饱和脂肪酸含量(1129.7 μg/g)，且不饱和脂肪酸约占总脂肪酸的85.01%。

3 结论

本文采用柱前衍生液相色谱-荧光检测/质谱联用的方法，对脂肪酸成分进行分析，并对所建立的方法进行了方法学验证。结果表明该方法简单、快速、检测灵敏度高、准确度和精确度高,可用于植物中脂肪酸的成分分析。该方法被成功的应用于沙棘种子中的脂肪酸成分分析，结果表明：沙棘种子中含有大量的不饱和脂肪酸，其比例可占总脂肪酸的85.01%。不饱和脂肪酸中主要以亚油酸、油酸和亚麻酸为主，分别为总脂肪酸的30.86%、26.01%和14.07%。