靶向VEGFR-3载阿霉素脂质微泡超声造影剂体外显影及寻靶能力的实验研究

叶 鸣 ，王志刚 ，周 鸿 ，牛诚诚 ，陈昶宇 ，刘 莹

（1.成都市第三人民医院-重庆医科大学附属成都第二临床学院，四川 成都 610010；2.重庆医科大学超声影像研究所，重庆 400010；3.中南大学湘雅二院超声科，湖南 长沙 410000）

随着超声分子显像技术的不断发展，靶向超声造影剂的设计及制备已成为目前的研究热点。靶向超声造影剂可以作为治疗药物或基因的载体，通过血液循环特异性地聚集于靶组织，观察靶组织在分子或细胞水平的特异性显像，在肿瘤治疗方面显示出巨大的潜力[1-2]。已有研究发现，血管内皮生长因子-C在诱导肿瘤淋巴管形成和促进肿瘤的淋巴结播散中起到至关重要的作用。而阻断VEGF-C/VEGFR-3信号途径在临床抗肿瘤淋巴管新生和肿瘤淋巴转移方面具有良好应用前景[3]。

本研究采用抗VEGFR-3单克隆抗体为配体，制备出靶向载药脂质微泡超声造影剂，探讨其在体外的显影效果及在人淋巴管内皮细胞上的体外寻靶能力，为下一步动物实验及临床应用打下实验基础。

1 资料与方法

1.1 材料与仪器

DSPE-PEG（2000）Biotin（Avanti，美国）；DPPC、DPPE、DPPA （Lipoid， 德国）； 阿霉素(Adriamycin)（Sigma，美国）；抗人VEGFR-3单克隆抗体（R&D systems，美国）；链亲和素（Sigma，美国）；N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯 （Biotiny-N-hy-droxy-succinimide，BNHS）HABA/Avidin 试剂（Sigma，美国）；荧光染料 DiI（Sigma，美国）；THZ-C 恒温振荡器（江苏太仓市实验设备厂）；高速冷冻离心机5804R（德国Eppendorf公司）；倒置荧光显微镜（Olympus CKX41，Japan）。

1.2 生物素化抗体的制备及检测

将抗人VEGFR-3单抗透析，加入到微孔滤膜管中，然后再向管中加入一定量的BNHS（1 mg/mL），孵育后离心，再加入PBS，混匀后再次离心，去除外管滤液，加入PBS制成样品溶液。将PBS加入比色皿中作为空白对照管，在另一比色皿中加入一定量HABA/Avidin试剂，分别测定于加入样品溶液前后其500 nm处的吸光度值A1、A2；在第三个比色皿中加入一定比例的PBS和样品溶液，并测定其在500 nm的吸光度值A3，根据HABA/Avidin试剂说明书中的公式计算，检测抗体的生物素化程度[4]。

1.3 载药靶向超声微泡的制备

称量阿霉素、成膜磷脂材料DSPE-PEG（2000）Biotin、DPPC、DPPE、DPPA， 按照一定比例混合，加入少量荧光染料DiI，溶于一定量1∶1的甲醛和三氯甲烷中，待甲醛和三氯甲烷自然挥发完全后，加入一定量的甘油和PBS，放入45℃的水域中孵育半小时，再冲入氟碳气体，经50 s振荡后得到载阿霉素脂质超声微泡。将上述制得的载药微泡加入过量的链亲和素中，低温振荡孵育半小时后，反复低温低速离心洗涤；然后加入上述所制备的生物素化抗人VEGFR-3单克隆抗体，再经低温孵育半小时，反复低温低速离心洗涤，便得到靶向VEGFR-3载阿霉素脂质微泡超声造影剂。

1.4 靶向载药超声脂质微泡的体外显影实验

将一系列按倍比稀释的靶向载药脂质微泡 （微泡平均浓度分别为 3.10×109个/mL、1.55×109个/mL、0.75×109个/mL）置入用凝胶（1%）制成的孔洞模型中，以PBS作为对照。采用Philips iU22超声诊断仪，基波成像模式，扫查声束与孔洞长轴垂直，应用机械指数（MI 0.7）的超声采集各孔中的超声图像。

1.5 倒置荧光显微镜下观察靶向载药脂质微泡超声造影剂对人淋巴管内皮细胞的结合情况

取对数生长期人淋巴管内皮细胞，以1×104/孔的密度接种于置有消毒盖玻片的6孔板底部。待细胞贴壁后，继续培养24 h，制备细胞爬片。预设为靶向造影剂实验组和空白对照组，各3张。吸干培养液，每组爬片采取不同操作：①靶向造影剂实验组内加入靶向载药脂质微泡超声造影剂200 μL；②空白对照组内加入非靶向载药脂质微泡超声造影剂200 μL。于 CO2培养箱内孵育 1 h。1 h 后，取出爬片，以PBS缓冲液反复冲洗每张片5次，在光镜和荧光显微镜下观察结合情况。

2 结果

2.1 抗体生物素化程度

根据HABA/Avidin试剂说明书公式算出，每个单克隆抗体分子平均可与9个生物素分子结合。

2.2 载药靶向微泡的物理性质

光镜下观察显示微泡呈球形，表面光滑，粒径大小较一致，分散较均匀，平均粒径为1.66 μm（图1）。

图1 靶向载药微泡粒径图。马尔文激光粒径仪测量靶向载药微泡的平均粒径为1.66 μm。Figure 1.Size of VEGFR-3-targeted lipid microbubble ultrasound contrast agents containing adriamycin.Itsmean diameter:1.66 μm.

2.3 靶向载药超声脂质微泡的体外显影效果

体外显影结果显示，与PBS对比，靶向载药脂质微泡显示高回声，且回声强度随微泡浓度减小呈下降趋势（图2）。

2.4 倒置荧光显微镜下观察靶向载药超声脂质微泡造影剂对人淋巴管内皮细胞的寻靶能力

400倍光镜下观察到：①载药靶向微泡造影剂组，较多量载药靶向微泡造影剂与人淋巴管内皮细胞紧密结合，主要分布在细胞周边以及细胞壁游离面上（图3）。②空白对照组，在PBS的反复冲洗下，细胞周围观察不到或仅见少量造影剂黏附。400倍荧光显微下观察，在与白光同一视野下：①载药靶向微泡造影剂实验组，可见大量靶向造影剂形成圆环，发出强烈红色荧光；②空白对照组，未见或仅见少量的荧光。

图2 靶向载药超声脂质微泡体外显影。1：PBS（MI=0.7）；2～4：靶向载药超声脂质微泡浓度分别为：0.75×109个/mL、1.55×109个/mL、3.10×109个/mL（MI=0.7）；5～8：靶向载药超声脂质微泡浓度为0.75×109个/mL，MI依次为0.6、0.5、0.4、0.3。 图3 靶向载药造影剂实验组结合情况图。光镜下及荧光镜下观察到较多的载药靶向超声微泡造影剂与人淋巴管内皮细胞紧密结合，且主要分布在细胞周边以及细胞壁游离面上。Figure 2. 1:PBS(MI=0.7);2～4:VEGFR-3-targeted lipid microbubble ultrasound contrast agents concentration:0.75×109/mL,1.55×109/mL,3.10×109/mL(MI=0.7);5～8:its concentration:0.75×109/mL,their MI were 0.6,0.5,0.4 and 0.3. Figure 3. Under electron microscope and light microscope,more closely conjugation of trageted lipid microbubble ultrasound contrast agents and human lymphatic endothelial cells,were displayed,and located around cells areas and free surface of cell walls.

3 讨论

随着靶向脂质微泡制备技术的不断发展，超声分子显像技术应运而生。超声分子显像主要是指经静脉输入靶向超声微泡造影剂，在体内通过受体与配体结合的方式，使靶向造影剂特异性停留于靶组织，应用超声造影技术来观察靶区在组织水平、细胞水平的成像，能够反映病变区组织在分子基础方面的变化。近年来，针对肿瘤淋巴管和转移淋巴结的超声分子成像研究逐渐成为热点[5]。

在实体肿瘤中，肿瘤细胞或其他间质细胞高表达VEGF-C、VEGF-D，通过激活VEGFR-3诱导淋巴管生成，增加的淋巴管密度使得肿瘤更容易进入淋巴管从而运输到区域淋巴结。由于肿瘤细胞的迅速生长，肿瘤内机械性压力和渗透压显著升高，周围的淋巴管不易伸入肿瘤组织，导致肿瘤内的淋巴管比周围的淋巴管稀疏而塌陷。淋巴管新生主要发生在肿瘤边缘和周围，肿瘤中央部缺乏或无淋巴管。因此，根据VEGF-C/VEGF-D/VEGFR-3信号通路以及其他信号通路在肿瘤转移中的重要性，靶向此通路可能阻断肿瘤淋巴结转移[6-7]。

对于那些不能手术的患者，通常采取化疗方式进行治疗，阿霉素是常用的肿瘤化疗药物之一，可用于多种肿瘤的治疗如肝癌，乳腺癌，软组织肉瘤等，然而目前临床应用制剂质量不稳定，且全身用药毒副反应严重，限制了其临床疗效的发挥。

本实验采用脂质微泡，可发挥其稳定性好、安全无毒，易于装载阿霉素等优点；生物素-亲和素连接法高效、稳定的将载药微泡与抗人VEGFR-3单克隆抗体相连，使其靶向淋巴管内皮细胞后，可以阻断VEGFR-3表达，抑制肿瘤诱导的淋巴管内皮细胞增殖，从而在一定程度上能抗肿瘤淋巴管新生和淋巴转移的作用。一定能量超声波触发下，释放阿霉素瞬时提高靶组织药物浓度，一定程度上局部治疗淋巴结内转移性肿瘤细胞，为减少药物在体内的全身毒副反应打下基础[8]。

综上所述，本研究制备的靶向VEGFR-3的载阿霉素脂质微泡超声造影剂，可以牢固的结合到淋巴管内皮细胞表面，在一定能量超声波触发下，释放阿霉素瞬时提高靶组织药物浓度，对定位及局部治疗肿瘤转移淋巴结有重要作用，为进一步在体内实验奠定较好的基础。

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[5]牛诚诚，郑元义，王志刚，等.靶向VEGFR-3超声造影剂的制备及其体外寻靶实验研究 [J].中国超声医学杂志，2012，28（7）：585-587.

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