RNA干扰YWHAZ基因对结肠癌HCT-8细胞增殖的影响

张成才，宋艳艳，周梦娇，崔志倩，张西臣，邢沈阳

(1. 吉林大学动物科学学院动物科学系，吉林 长春 130062；2. 吉林大学第二医院肾病内科，吉林 长春 130041；3. 吉林大学动物医学学院预防兽医学系，吉林 长春 130062)

RNA干扰YWHAZ基因对结肠癌HCT-8细胞增殖的影响

张成才1，宋艳艳2，周梦娇1，崔志倩1，张西臣3，邢沈阳1

(1. 吉林大学动物科学学院动物科学系，吉林 长春 130062；2. 吉林大学第二医院肾病内科，吉林 长春 130041；3. 吉林大学动物医学学院预防兽医学系，吉林 长春 130062)

目的：探讨中RNA干扰YWHAZ基因对结肠癌HCT-8细胞增殖的影响，阐明其作用机制。方法：构建靶向基因YWHAZ的siRNA载体重组质粒pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-792、pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-733、pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-612和pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-505作为RNA干扰质粒组，同时设立阴性对照质粒组(pGPU6/GFP/Neo-shNC质粒)；采用荧光定量PCR检测YWHAZ mRNA的表达水平和表达抑制率；采用MTT法检测HCT-8细胞的增殖率。结果：倒置荧光显微镜下观察，细胞转染率为60%。荧光定量PCR检测，RNA干扰组YWHAZ mRNA表达水平低于阴性对照组(P<0.01)，平均抑制率为52.86%。MTT检测，与阴性对照组比较，RNA干扰质粒组细胞增殖率明显降低(P<0.01)，平均细胞增殖率为68.75%。结论：干扰YWHAZ可抑制该基因的转录，并抑制HCT-8细胞的增殖。

YWHAZ基因；结肠肿瘤；HCT-8细胞；RNA干扰

在常见的恶性肿瘤中，结肠癌的发病率呈逐年增加趋势，寻找特异的诊断及治疗靶点十分重要。YWHAZ属于14-3-3基因家族，其家族成员有7种亚型β、γ、ζ、η、ε、σ和τ，是一个在真核生物中广泛表达的酸性蛋白家族，其中14-3-3ζ的编码基因为YWHAZ。研究[1-8]表明：YWHAZ在肿瘤迁移、抑制细胞凋亡和调控信号传导等方面发挥重要作用，其在胃癌、肺癌及肝癌等多种恶性肿瘤组织中均表达异常。YWHAZ与肿瘤的发生有密切的关联，其过表达可引起抑癌基因p53表达水平下降导致肿瘤发生[9-10]，但YWHAZ对结肠肿瘤发生发展的影响尚不明确。本实验通过干扰结肠癌细胞系中YWHAZ mRNA的表达，观察结肠癌细胞的增殖情况，采用RNAi技术了解YWHAZ对结肠癌的影响，以期为结肠癌的有效治疗提供一个新的基因靶点。

1　材料与方法

1.1细胞、质粒和主要试剂结肠癌HCT-8细胞由本实验室保存；干扰YWHAZ质粒由上海吉玛制药技术有限公司设计合成；细胞总RNA提取试剂Trizol购自美国Invitrogen公司，反转录试剂盒购自上海TOYOBO生物科技有限公司，FuGENE HD转染试剂购自美国Promega公司，RPMI-1640培养基购自上海浩然生物技术有限公司，SYBR Green荧光定量染料购自大连Takara宝生物工程有限公司。

1.2干扰质粒的构建和实验分组由上海吉玛制药技术有限公司根据NM003406基因序列设计合成干扰质粒。实验分为RNA干扰质粒组(干扰质粒分别为pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-792、pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-733、pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-612、pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-505)和阴性质粒对照组(pGPU6/GFP/Neo-shNC)。

1.3结肠癌HCT-8细胞的瞬时转染待转细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在37℃、5%CO2的培养箱中培养至对数生长期，待细胞融合度达60%～70%时弃去上清，加入室温孵育15 min后的干扰质粒与FuGENE HD转染试剂的混合液(转染试剂∶质粒=5 μL∶2 μg)及不含血清的RPMI-1640培养基，置于37℃、5%CO2条件下培养6 h。倒掉含转染试剂的培养基，加入含10%胎牛血清的培养基培养20 h。在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光表达情况，统计发光细胞数量，计算转染效率，转染效率=发光细胞数/细胞总数×100%。

1.4细胞总RNA的提取及反转录cDNA利用Trizol法提取各组细胞总RNA，测定RNA浓度，并调整一致。TOYOBO反转录体系：Total RNA 7.0 μL、RT-primer 0.5 μL、RT Enzyme Mix 0.5 μL、5×RT Buffer 2.0 μL，反转录为cDNA，-80℃保存备用，在进行PCR反应之前以1∶10稀释。

1.5荧光定量PCR法检测YWHAZ基因mRNA的表达水平和表达抑制率根据YWHAZ序列设计引物，上游引物：5′-ATTGAGACGGAGCTAAGAGATATCT-3′;下游引物：5′-CTCAGCCAAGTAACGGTAGTAATCT-3′;设置内参为β-actin，内参上游引物：5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′；下游引物：5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。荧光定量PCR反应20.0 μL体系：cDNA 2.0 μL、PCR-Master Mix 10.0 μL、PCR-F-Primer 0.5 μL、PCR-R-Primer 0.5 μL、RNase free H2O 7.0 μL，每份样本重复3次。反应条件：95℃预变性1 min；95℃变性5 s，60℃退火30 s，40个循环。产物4℃保存备用。通过Ct值计算机自动生成原始定量结果，按照相对定量的方法，利用YWHAZ基因与内参β-actin的定量结果计算2-ΔΔCt值，YWHAZ mRNA表达抑制率=(1-YWHAZ基因相对表达水平)×100%。

1.6MTT法检测HCT-8细胞增殖率将含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养的细胞吹打为单细胞悬液，接种到96孔板内(每孔200 μL，约含5×103个细胞)，每组6个重复，37℃、5%CO2培养12～24 h，每孔加入20 μL MTT溶液，4 h后弃去培养基，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，放入摇床振荡10 min，使结晶物充分溶解。利用酶联免疫检测仪于490 nm波长处测定各孔吸光度(A)值。以时间、A490值分别为横、纵坐标绘制生长曲线。细胞增殖率=实验组平均A值/对照组平均A值×100%。

2　结　果

2.1RNA提取收集转染后RNA干扰质粒组及阴性质粒对照组细胞，利用Trizol法提取细胞总RNA，经2%的琼脂糖凝胶电泳检测可知，RNA提取效果较好，5s、18s和28s条带清晰。见图1。

Lanes 1-4:RNA interference plasmid group; Lane 5:Negative control plasmid group.

图1各组YWHAZ RNA表达电泳图

Fig.1Electrophoregram of expressions of YWHAZ RNA in various groups

2.2重组质粒瞬时转染细胞的转染效率利用倒置荧光显微镜观察转染后的细胞，可观察到绿色荧光(图2，见插页五)，表明重组的质粒成功转入HCT-8细胞中，通过细胞计数，计算转染效率为60%。

2.3各组YWHAZ mRNA表达水平和表达抑制率RNA干扰质粒组YWHAZ mRNA表达水平分别为0.40±0.01、0.42±0.03、0.56±0.02和0.40±0.04，均低于阴性质粒对照组(1.05±0.05)(P<0.01)；RNA干扰质粒组YWHAZ mRNA表达抑制率分别为57.14%、55.23%、41.90%和57.14%，平均抑制率为52.86%。

2.4各组HCT-8细胞增殖率以各组HCT-8细胞A490值的平均值作为纵坐标，以时间作为横坐标绘制生长曲线(图3)。RNA干扰质粒组HCT-8细胞7 d后A值分别为1.62±0.14、1.49±0.11、1.49±0.15和1.55±0.14，均低于阴性质粒对照组(2.23±0.12)(P<0.01)；RNA干扰质粒组HCT-8细胞增殖率分别为72.65%、66.82%、66.82%和69.51%，平均增殖率为68.75%。

图3　各组HCT-8细胞生长曲线

Fig.3Proliferation curves of HCT-8 cells in various groups

3　讨　论

14-3-3蛋白家族在肿瘤的形成和发展过程中扮演着重要的角色，研究[11]表明：其可以调节蛋白之间的相互作用并作为信号分子参与到肿瘤生长过程中。在其家族基因中，14-3-3σ已被证实为抑癌基因[12]，14-3-3β与14-3-3γ也被证明有促进肿瘤形成的作用[13]。作为一个潜在的原癌基因[14]，YWHAZ基因对肿瘤的影响及作用机制正逐步成为一个新的研究方向。Bajpai等[15]在对食管鳞状上皮癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)的研究中发现：14-3-3ζ在ESCC组织中呈高表达。TsuKamoto等[16]对转染miRNA-375的胃癌细胞中14-3-3ζ mRNA和蛋白表达的研究表明：14-3-3ζ有促进肿瘤细胞生长的作用。Maxwell等[17]在CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松)化疗方案耐药细胞系的研究结论也与这一观点一致。这些研究结果均表明YWHAZ与肿瘤的发生发展有密切关联。

YWHAZ基因在结肠癌的相关研究中报道较少，本实验利用RNAi技术特异性识别并降解具有同源序列mRNA的能力，观察干扰YWHAZ基因后，其在结肠癌HCT-8细胞中转录水平及细胞增殖水平的差异。本研究结果显示：在HCT-8细胞中，YWHAZ mRNA的表达水平明显下降，细胞增殖率显著降低，说明YWHAZ基因与结肠癌的发生发展有一定的联系。研究[18-19]显示：在肺癌细胞系中下调YWHAZ的表达水平时，细胞中Bad、Bim/Mcl和Bax等促凋亡因子表达水平升高，肺癌细胞凋亡率升高。Matta等[20-22]发现：14-3-3ζ蛋白通过与NF-κB、β-连环蛋白和Bcl-2结合参与到细胞信号转导通路来提高口腔鳞状癌细胞的增殖。本研究结果显示：结肠癌细胞增殖率降低，可能为干扰YWHAZ mRNA的表达使相应的14-3-3ζ表达水平下降，导致细胞中促凋亡因子表达水平升高所致，也可能是14-3-3ζ表达水平降低造成和细胞信号转导通路中断所致。有关YWHAZ基因在结肠癌中的作用机制有待进一步研究。

综上所述，本实验通过RNAi技术成功干扰HCT-8细胞中YWHAZ mRNA的表达水平，使得细胞增殖率显著降低，初步了解了YWHAZ基因对结肠癌细胞的影响。结合本实验及其他学者的研究推测：YWHAZ基因有可能作为一个新的诊断和治疗结肠癌的靶点。

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Effect of RNA interference of YWHAZ gene on proliferation of colon cancer HCT-8 cells

ZHANG Chengcai1，SONG Yanyan2，ZHOU Mengjiao1，CUI Zhiqian1，ZHANG Xichen3，XING Shenyang1

(1. Department of Animal Science,School of Animal Science,Jilin University,Changchun 130062, China;2. Department of Nephrology,Second Hospital,Jilin University,Changchun 130041,China; 3. Department of Preventive Veterinary Medicine,School of Veterinary Medicine, Jilin University,Changchun 130062,China)

ObjectiveTo investigate the effect of RNA interference of YWHAZ gene on the cell proliferation of colon cancer HCT-8 cells,and to elucidate the mechanism.Results Four siRNA plasmids targeting human YWHAZ gene,including pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-792,pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-733,pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-612,and pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-505, were constructed and regarded as RNA interference plasmid groups. pGPU6/GFP/Neo-shNC plasmid was regarded as negative control plasmid group. RT-PCR was used to detect the expression of YWHAZ mRNA and the inhibitory rates of HCT-8 cells; the proliferation rate of HCT-8 cells was detected by MTT method. ResultsThe transfection rate of cells was 60% under inverted fluorescence microscope;the RT-PCR results showed that the levels of YWHAZ mRNA in RNA interference plasmid groups were lower than those in negative control plasmid group(P<0.01),and the average inhibitory rate was 52.86%. The MTT results showed that compared with negative control plasmid group,the proliferation rates of HCT-8 cells in RNA interference plasmid groups were decreased (P<0.01),and the average proliferation rate was 68.75%. ConclusionInterference of YWHAZ gene might inhibit the transcription of the gene,and further inhibit the proliferation of HCT-8 cells.

YWHAZ gene;colon neoplasms;HCT-8 cells;RNA interference

1671-587Ⅹ(2015)02-0307-04

10.13481/j.1671-587x.20150220

2014-11-06

吉林省科技厅科技发展计划项目资助课题(2003055025，20106044)；吉林省自然科学基金资助课题(20101585)

张成才(1989-)，男，山东省潍坊市人，在读动物科学硕士，主要从事肿瘤遗传学方面的研究。

邢沈阳，教授，硕士研究生导师(Tel:0431-87835138,E-mail:xingsy6177@163.com)

R735.3

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