内皮祖细胞条件培养基对间充质干细胞增殖和成骨分化的影响及其机制

冯文磊，张　猛，徐芳洁，印双红，王艳杰，陈雪玲， 吴向未

(1. 石河子大学医学院第一附属医院普外科，新疆 石河子 832008；2. 石河子大学医学院免疫学教研室，新疆 石河子 832002)

内皮祖细胞条件培养基对间充质干细胞增殖和成骨分化的影响及其机制

冯文磊1，张猛1，徐芳洁2，印双红2，王艳杰1，陈雪玲2， 吴向未1

(1. 石河子大学医学院第一附属医院普外科，新疆 石河子 832008；2. 石河子大学医学院免疫学教研室，新疆 石河子 832002)

目的: 探讨小鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs)条件培养基(CM) 对同源间充质干细胞(MSCs)增殖和成骨分化功能的影响，并阐明其作用机制。方法: 小鼠骨髓细胞经差速贴壁法结合专用培养基分别培养扩增MSCs和EPCs,采用流式细胞术(FCM)检测MSCs和EPCs表面标记物,以成骨、成脂和成软骨诱导分化对MSCs进行功能鉴定，以成血管对EPCs进行功能鉴定。将MSCs分为0% EPCs-CM组(对照组，采用LG-DMEM培养)、50% EPCs-CM组(采用50% EPCs-CM+50% LG-DMEM培养)和100% EPCs-CM 组(采用100% EPCs-CM培养)。采用MTT比色法检测各组MSCs的增殖活性；采用茜素红染色检测各组MSCs的成骨分化能力。结果: FCM法检测，第3代MSCs高表达Sca-1、CD29， 低表达CD45、CD11b；经诱导可向成骨、成软骨和成脂方向分化。第3代EPCs 高表达CD34、CD133和VEGFR2；在铺有基质胶的96孔培养板中可形成血管样结构。与对照组比较，50% EPCs-CM组和100% EPCs-CM组MSCs增殖活性明显增加,且呈浓度依赖性(P<0.05)。茜草色素红染色法检测，培养21 d后50%和100% EPCs-CM组MSCs的钙结节数量和钙盐沉积均高于对照组(P<0.05)。结论:利用差速贴壁法可同时分离MSCs和EPCs，EPCs-CM能促进MSCs 的增殖和成骨分化。

内皮祖细胞；间充质干细胞；条件培养基；细胞增殖；成骨分化

由创伤、感染、畸形矫正和肿瘤等各种因素造成的骨缺损，骨缺损不仅不易愈合，还因固定和制动易导致褥疮、呼吸系统感染、泌尿系统感染及患肢废用性萎缩等多种并发症。传统治疗方法有自体松质骨移植和异体骨移植，但存在供骨区损伤、术后并发症、来源有限和排斥反应等问题。组织工程骨是一种全新的治疗方法，包含4个关键元素：具有骨传导性的支架、释放诱导成骨的生长因子、负载具有成骨潜能的细胞和组织工程骨血管化或充足的血供[1]。骨髓中至少存在3种干/祖细胞系统：间充质干细胞( mesenchymal stem cells，MSCs)系统、内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)系统和造血干细胞系统，并且相互之间存在密切联系[2]。MSCs是中胚层来源的具有高度自我更新增殖能力和多向分化潜能的多能干细胞[4]，在特定条件下能分化为骨、软骨和脂肪等多种组织细胞[4]。EPCs是一类能高度增殖、特异分化为血管内皮细胞、但尚未表达成熟的血管内皮细胞表型的祖细胞[5]。EPCs不仅参与胚胎期血管发生，也参与成体血管新生和内皮损伤后修复[6]。虽然人们早已认识到血管化在骨形成修复中的重要作用，但是成血管细胞促进骨再生修复的机制尚未完全明了。本研究旨在从细胞水平探讨具成血管潜能的EPCs对具成骨潜能的MSCs的增殖和成骨能力的生物学影响，为阐明血管化与骨形成之间的生物耦联机制提供依据。

1　材料与方法

1.1动物、主要试剂和仪器

4～6 周龄 C57B/L6 小鼠购自新疆医科大学实验动物中心,动物合格证号 ：SCXK(新)2011-0001)；胎牛血清、LG-DMEM培养基( Gilbco 公司,美国),PBS、 2.5 g·L-1胰蛋白酶 (HyClone 公司，美国),EGM2-MV培养基( Lonza公司,瑞士),青霉素和链霉素(SolarBio公司,中国),人纤连蛋白(BD公司，美国),MTT和DMSO(Sigma公司，美国),多聚甲醛固定液(赛驰生物科技公司，中国),成骨、成软骨、成脂诱导培养基和茜素红、阿利新蓝、油红O染料(Cyagen Biosciences公司,美国)，基质胶( BD Biosciences公司,美国),抗小鼠sca-1-FITC、CD29-APC、CD45-PerCP-Cy5.5、CD11b-PE、CD34-FITC、CD133-PE、VEGFR2-APC 和抗小鼠IgG 同型对照(eBioscience公司,美国),氯化十六烷基吡啶(Amresco公司，美国);细胞培养皿、培养板(Coning公司,美国)，酶标仪(Bio-Rad公司，美国),荧光倒置相差显微镜及图像采集系统(Leica公司,德国),流式细胞仪(BD公司，美国)。

1.2MSCs和EPCs分离培养

取1只4～6周龄C57B/L6小鼠,肝素化30 min后脱颈处死，75%酒精浸泡5 min，超净台中用已灭菌手术器械分离小鼠下肢，取股骨与胫骨并剔除干净肌肉组织与筋膜，置于PBS中。转入另一超净台，剪去长骨两端骨骺,以5 mL注射器吸取含10% FBS的LG-DMEM培养基换1 mL注射器针头反复冲洗骨髓腔直至发白,冲出骨髓至60 mm培养皿中，吹打均匀放入37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱内培养,48 h后轻轻晃动培养皿,换新鲜含10%FBS的LG-DMEM培养基继续培养MSCs,同时收集离心未贴壁细胞,以EGM-2MV培养基在预先包被人纤连蛋白的60 mm培养皿中继续培养,2 d后吸除旧培养基和未贴壁细胞换新鲜EGM-2MV培养基继续培养来扩增EPCs。MSCs和EPCs培养基均每2 d换液1次。原代培养的MSCs与EPCs至80%～90%融合时皆按1∶2 传代。

1.3流式细胞术检测MSCs和EPCs的表面标记物

分别取处于对数生长期的第3代MSCs和EPCs，待细胞80%～90%融合时,2.5 g·L-1胰蛋白酶消化3～5 min，1 000 r·min-1离心5 min,弃上清，PBS清洗2次，PBS重悬细胞，吹打均匀调整细胞密度为1×106mL-1，分装每管100 μL，分别加入直接荧光标记MSCs 抗小鼠sca-1-FITC、CD29-APC、CD45-PerCP-Cy5.5、CD11b-PE和直接荧光标记EPCs 抗小鼠CD34-FITC、CD133-PE、VEGFR2-APC。分别以IgG-FITC、IgG-APC、IgG-PerCP-Cy5.5和IgG-PE 为同型对照。 4℃ 孵育1 h，每 15 min 轻摇1次。1 000 r·min-1离心3 min，PBS洗去未标记上的抗体，10 g·L-1多聚甲醛固定10 min,流式细胞术检测MSCs和EPCs的表面标记物表达。MSCs以高表达Sca-1和CD29、低表达CD45和CD11b为满意结果；EPCs以均高表达CD34、CD133和VEGFR2为满意结果。实验重复3次。

1.4MSCs和EPCs的功能鉴定

1.4.1MSCs成骨诱导分化第2代细胞80%～90%融合时，胰酶消化3～5 min，1 000 r·min-1离心5 min，调整细胞密度以3×104cm-2在6孔板用成骨诱导分化培养基培养3周,茜草色素红染色后镜下观察钙结节形成情况。以钙结节被茜素红染为红色为阳性结果。

1.4.2MSCs成软骨诱导分化第2代细胞 80%～90%融合时，胰酶消化3～5 min，1 000 r·min-1离心5 min,调整细胞密度以3×104cm-2在6孔板中用成软骨诱导分化培养基培养3周,阿利新蓝染色后镜下观察，以细胞被阿利新蓝染为蓝色为阳性结果。

1.4.3MSCs成脂诱导分化第2代细胞 80%～90%融合时，胰酶消化3～5 min，1 000 r·min-1离心5 min，调整细胞密度以3×104cm-2在6孔板培养至100%铺满，成脂诱导分化培养基培养3 d,换成LG-DMEM培养基，24 h换成诱导培养基，循环3～5次，最后LG-DMEM培养基培养7 d，油红O染色后镜下观察脂滴形成情况，以脂滴被油红O染为红色为阳性结果。

1.4.4EPCs的体外成血管能力检测在96孔板的每孔中铺50 μL基质胶，消化第3代 EPCs，EGM-2MV培养基制成单细胞悬液，细胞计数，按每孔2×104个细胞接种于基质胶上，轻轻拍打，使细胞接种均匀。倒置显微镜观察血管形成情况，以能形成血管样结构为阳性结果。

1.5EPCs-CM 的制备

取经过鉴定后的第3～5代EPCs以1×105个细胞密度接种至60 mm培养皿中，待细胞达到80%～90%融合后换液时收集旧培养基,2 000 r·min-1离心 5 min,取上清液加入10% FBS即为 EPCs-CM。重复制备，直至足量。经 0.22 μm 滤膜过滤,贮存于-80 ℃ 冰箱中备用。

1.6MTT比色法检测EPCs-CM培养MSCs增殖活性

取第2代MSCs，用含10%胎牛血清的LG-DMEM培养基制备细胞悬液，以 5×104mL-1接种于96孔培养板内，每孔加入100 μL，培养12 h后，吸去培养基，加入含10%FBS及不同浓度(0、50%和100%)EPCs-CM的LG-DMEM 培养基100 μL，分别为0% EPCs-CM组(对照组)、50% EPCs-CM组和100% EPCs-CM组,每组设5个复孔，继续培养48 h。每孔加入10 μL MTT，培养4 h后弃去上清液，每孔加入150 μL DMSO，震荡仪低速震荡10 min,酶标仪检测492 nm波长处的吸光度(A)值，表示各组MSCs增殖活性。各组设与实验平行不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色以空白孔A值调零。实验重复3次。

1.7茜草色素红染色和比色法检测MSCs成骨能力

第2代细胞培养至80%～90%融合时，胰酶消化3～5 min，1 000 r·min-1离心5 min， 调整细胞密度以 3×104cm-2接种至6孔板中。对照组加2 mL诱导培养基，50% EPCs-CM组加1.5 mL诱导培养基再加0.5 mL EPCs-CM,100% EPCs-CM组加1 mL诱导培养基再加1 mL EPCs-CM,每组设3个复孔。诱导培养3周,茜草色素红染色，镜下观察钙结节形成情况并选取5 个视野( 中央和3、6、9、12 点位置)双盲计数，每孔加入0.1 mol·L-1氯化十六烷基吡啶1 mL室温反应20 min，震荡仪低速震荡10 min,酶标仪检测570 nm波长处的A值，以A值表示MSCs成骨能力。最后比色以空白孔A值调零。实验重复3次。

1.8统计学分析

2　结　果

2.1MSCs 和EPCs 的形态学

MSCs于48 h内贴壁，细胞形态不均一、异形性大，有成纤维样细胞，也有大、小圆形细胞和多角形细胞；培养2 d时可见集落形成，沿集落周边细胞迅速生长；培养约12 d时细胞铺满，以纺锤形样细胞为主,经传代培养后形态渐趋均一呈“漩涡”状。见图1A和B(插页一)。48 h后细胞悬液离心，细胞沉淀重悬于纤维连结蛋白预包被的60 mm培养皿中；2 d后2次贴壁的EPCs开始伸展成梭形；约4 d时见细胞集落形成，集落中央为圆形细胞群，周边有梭形细胞放射性生长；12 d时细胞可达到80%～90%融合，以类圆形和多角形细胞为主，晚期呈“铺路石”状。见图1C和D(插页一)。

2.2MSCs和EPCs的表面标记物表达阳性率

第3代MSCs高表达Sca-1和CD29,表达阳性率分别为(98.30±0.75)%和(97.47±1.32)%；低表达CD45和CD11b,表达阳性率分别为(1.87±0.15)%和(1.03±0.71)%。见图2。

第3代EPCs均高表达CD34、CD133和VEGFR2，表达阳性率分别为(88.90±1.18)%，(92.73±2.90)%和(87.63±1.79)%。见图3。

A-D: Homotype control;E-H: Surface marker;A,E: Sca-1;B,F: CD29;C,G: CD45;D,H: CD11b.

A-C:Homotype control;D-F:Surface marker;A,D:CD34;B,E:CD133;C,F:VEGFR2.

2.3MSCs和EPCs的功能鉴定

第3代MSCs 诱导分化成骨细胞，经成骨诱导后，形态由梭形变为不规则形，诱导14 d时可见散在分布小褐色结节，诱导21 d后结节中心的细胞逐渐融合失去细胞结构，钙结节形成明显，经茜草色素红染色呈红色结节(图4A，见插页一)。

第3代 MSCs 诱导分化成软骨细胞，经成软骨诱导后，细胞形态变化不大，诱导21 d后行阿利新蓝染色，镜下可见诱导分化形成的软骨细胞胞核被染成深蓝色，胞质染成浅蓝色(图4B，见插页一)。

第3代MSCs诱导分化成脂肪细胞，细胞成脂诱导后，形态变不规则,部分细胞中有小脂滴形成，诱导21 d后融合成大脂滴，经油红O 染色，脂滴被染成鲜红色(图4C，见插页一)。

第3代 EPCs体外形成血管腔样结构，镜下观察，2～5 h后 细胞变形拉长，6～9 h细胞迁移聚集，首尾相接，形成血管腔样结构，10～12 h达到顶峰(图4D，见插页一)。

2.4MSCs的增殖情况

MTT比色法：随着 EPCs-CM 浓度的增加，MSCs增殖活性逐渐增加。50%EPCs-CM 组和100% EPCs-CM 组MSCs的增殖活性(0.233±0.033和0.324±0.023)均高于对照组(0.157±0.020)(P<0.05或P<0.01)。

2.5MSCs经诱导后钙离子沉积情况

钙结节计数：与对照组(8.33±0.57)比较，50%EPCs-CM组和100%EPCs-CM组MSCs的平均钙结节数(13.00±1.00和21.67±2.52)明显增加(P<0.05或P<0.01 )。A570值检测：与对照组(0.177±0.017)比较，50%EPCs-CM组和100%EPCs-CM组MSCs的A570值(0.254±0.029和0.33±0.021)明显升高(P<0.05或P<0.01)。见图5(插页一)。

3　讨　论

1976 年Friedenstein 等[7]首次从骨髓中分离出MSCs，1997 年Asahara 等[8]首次从外周血中分离出EPCs,但随后研究[9]证实EPCs源于骨髓。相较于其他组织来源，骨髓中的MSCs和EPCs更为丰富，且增殖能力更强[10]。本研究利用 MSCs与EPCs 差时贴壁的特性[11]从一份骨髓中一次性将2种细胞分离出来，此方法简单易行，避免了分选和反复离心造成的细胞损伤和丢失，最大程度保存了MSCs和EPCs 生长所需的微环境，可使其保持旺盛的增殖能力。本研究结果表明：骨髓中的MSCs 贴壁时间较快,培养2～5 h 即可贴壁,而EPCs 贴壁较慢,实验在贴壁培养48 h后收集未贴壁细胞，以专用培养基培养,可以粗略地将MSCs和EPCs分离。但是差时贴壁的细胞成分仍较复杂,需多次传代以逐渐提高细胞纯度。

由于MSCs和EPCs 形态相近并且同一种细胞在不同阶段形态并不一致，所以单从形态学方面不可能对这2种细胞进行鉴定，目前国内外普遍结合细胞表面标志物和细胞分化功能来鉴定。然而目前学术界对于MSCs和EPCs鉴定的表面标志物至今无统一标准，较为公认的MSCs表面标记物是高表达Sca-1、CD29、CD73、CD90、CD105和CD44，同时低表达或不表达CD45、CD11b和CD34等[4，12]。而研究者普遍认为EPCs高表达CD34、CD133和VEGFR2[13]，与此相对应，MSCs功能鉴定的金标准是其向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的分化潜能[4,14]；针对EPCs的功能鉴定是其能在基质胶上形成血管腔样结构[14]。本研究结果显示：MSCs高表达Sca-1和CD29，低表达CD45和CD11b，EPCs则高表达CD34、CD133和VEGFR2；功能鉴定结果显示：MSCs可向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞方向分化，EPCs可在基质胶上形成血管腔样结构，具有MSCs和EPCs特性。

骨是高度血管化的组织，骨缺损导致血供破坏或中断，所以不论是自体MSCs 的动员、归巢还是体内MSCs 移植均有低氧或缺氧期。已有研究[15]显示：缺氧可抑制或减弱MSCs的成骨分化能力。而EPCs 可分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基质细胞衍生因子1 (stromal cell-derived factor,SDF-1)、 胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)[16]、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF )、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)[17]、转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)[18]等多种生长因子，这些生长因子 对EPCs 本身的存活、增殖和分化有促进作用。体外培养的EPCs 通过旁分泌作用将细胞因子分泌到培养基中，检测其旁分泌作用对MSCs的影响,最简单的方法就是使用含 EPCs分泌物或代谢产物条件培养基作用于MSCs,观察其对MSCs相关功能的影响。本实验采用 MTT比色法检测EPCs-CM 对MSCs 增殖影响的结果显示：EPCs-CM可以促进MSCs的增殖并随着EPCs-CM 浓度的增加，其促增殖作用更加明显，呈现浓度依赖性。茜素红染色是常规用于检测MSCs钙盐沉积情况的染色方法，可将钙盐染成红色。 氯化十六烷基吡啶能将钙盐结节溶解使钙离子析出，从而可在酶标仪上定量检测钙盐沉积情况。本研究采用成骨诱导后，茜素红染色计数钙结节数目，然后加氯化十六烷基吡啶溶解钙结节，经酶标仪检测其吸光度，以观察EPCs-CM 对MSCs 成骨分化的影响，结果显示：EPCs-CM可以促进MSCs向成骨方向分化，也呈一定的浓度依赖性。由此可见EPCs-CM含有的某种或某几种生长因子或者其他的代谢产物促进了MSCs的存活增殖及向成骨方向分化。

骨缺损的修复再生是复杂而精细的体内过程。本研究采用含有生长因子和其他代谢产物的EPCs-CM探讨其对MSCs 的增殖与成骨分化的影响。本文作者后续实验将探讨是何种细胞因子促增殖、促成骨能力最强或相互之间有无协同作用,如何组合协同作用更明显；EPCs密度确定情况下分泌的细胞因子的量及用抗体阻断后对MSCs增殖和成骨能力的影响；通过何种信号通路来调控增殖分化作用，信号通路之间有无连接点。本文作者期望未来将2种细胞联合移植至组织工程骨中更好地促进骨的形成和血管化，使组织工程骨在骨缺损的临床治疗中发挥更大作用。

[1]Cancedda R,Giannoni P,Mastrogiacomo M.A tissue engineering approach to bone repair in large animal models and in clinical practice[J].Biomaterials, 2007,28(29):4240-4250.

[2]Laine SK,Hentunen T,Laitala-Leinonen T.Do microRNAs regulate bone marrow stem cell niche physiology[J].Gene,2012,497(1): 1-9.

[3]Ghannam S,Bouffi C,Djouad F,et al.Immunosuppression by mesenchymal stem cells: mechanisms and clinical applications[J].Stem Cell Res Ther, 2010,15(1):2.

[4]Wu X,Pang L,Lei W,et al.Inhibition of sca-1 positve skeletal stem cell recruitment by alendronate blunts the anabolic effects of parathyroid hormone on bone remodeling[J].Cell Stem Cell,2010,7(5): 571-580.

[5]Peichev M,Naiyer AJ,Pereira D,et al.Expression of VEGFR-2 and AC 133 by Circulating human CD34(+) cells identifies a population of functional endothelial precursors[J].Blood,2000,95(3):952-958.

[6]Hill JM,Zalos G,Halcox JP,et al.Circulating endothelial progenitor cells, vascular function,and cardiovascular risk[J].N Engl J Med,2003, 348(7):593-600.

[7]Friedenstein AJ,Gorskaja JF,Kulagina NN.Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs[ J].Exp Hematol,1976,4( 5) : 267-274.

[8]Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science,1997,275(5302):964-967.

[9]Asahara T,Masuda H,Takahashi T,et al.Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization[J].Circ Res,1999,85(3):221-228.

[10]Tongers J,Roncalli JG,Losordo DW.Role of endothelial progenitor cells during ischemia-induced vasculogenesis and collateral formation [J].Microvasc Res,2010,79(3):200-206.

[11]Casamassimi A,Balestrieri ML,Fiorito C,et al.Comparison between total endothelial progenitor cell isolation versus enriched CD133+culture[J].J Biochem,2007,141(4):503-511.

[12]Lee JW,Gupta N,Serikov V,et al．Potential application of mesenchymal stem cells in acute lung injury[J].Expert Opin Biol Ther,2009,9( 10) : 1259-1270.

[13]Navarro-Sobrino M,Hernández-Guillamon M,Fernandez-Cadenas I,et al. The angiogenic gene profile of circulating endothelial progenitor cells from ischemic stroke patients[J].Vasc Cell,2013,5(1):1-7.

[14]Li Q,Wang Z.Influence of mesenchymal stem cells with endothelial progenitor cells in co-culture on osteogenesis and angiogenesis: aninvitrostudy[J].Arch Med Res,2013,44(7):504-513.

[15]Xu N,Liu H,Qu F,et al.Hypoxia inhibits the differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts by activation of Notch signaling[J]. Exp Mol Pathol,2013,94(1):33-39.

[16]Urbich C,Aicher A,Heeschen C,et al.Soluble factors released by endothelial progenitor cells promote migration of endothelial cells and cardiac resident progenitor cells[J].J Mol Cell Cardiol,2005,39(5):733-742.

[17]He T,Smith LA,Harrington S,et al. Transplantation of circulating endothelial progenitor cells restores endothelial function of denuded rabbit carotid arteries[J].Stroke,2004,35(10):2378-2384.

[18]Doyle B,Sorajja P,Hynes B,et al.Progenitor cell therapy in a porcine acute myocardial infarction model induces cardiac hypertrophy,mediated by paracrine secretion of cardiotrophic factors including TGF beta1[J].Stem Cells Dev,2008,17(5):941-951.

Effects of endothelial progenitor cells conditioned medium on proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells and their mechanisms

FENG Wenlei1， ZHANG Meng1， XU Fangjie2，YIN Shuanghong2，WANG Yanjie1，CHEN Xueling2， WU Xiangwei1

(1. Department of General Surgery，First Affiliated Hospital， College of Medical Sciences, Shihezi University，Shihezi 832008，China；2. Department of Immunology，College of Medical Sciences,Shihezi University，Shihezi 832002，China )

ObjectiveTo investigate the effects of bone marrow-derived endothelial progenitor cells(EPCs) conditioned medium(EPCs-CM) on the proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells(MSCs),and to clarify the mechanisms.MethodsThe EPCs and MSCs were isolated from bone marrow of the mice using differential adhesion method.The surface markers of EPCs and MSCs were identified by flow cytometry (FCM).The osteogenic,chondrogenic,and adipogenic induction differentiation abilities of the MSCs were identified.The function of EPCs was identified by tube formation experiment.The MSCs were divided into 0% EPCs-CM group(control group,cultured with LG-DMEM),50% EPCs-CM group(cultured with 50% EPGs-CM and 50% LG-DMEM),and 100% EPCs-CM group(cultured with 100% EPCs-CM).The proliferation activities of the MSCs in various groups were detected by MTT method;the osteogenic differentiation abilities of the MSCs in various groups were detected by Alizarin red staining. ResultsThe FCM results showed that the third passage MSCs were strongly positive for Sca-1,CD29 and negative for CD45,CD11b and could be induced to complete differentiation process into osteoblasts and adipocytes and chondrocytes.The third passage EPCs cultured on Matrigel showed tube-like structures and highly expressed CD34,CD133 and VEGFR2.Compared with control group,the proliferation activities of the MSCs in 50% EPCs-CM group and 100% EPCs-CM group were increased(P<0.05),which presented a dose-dependent manner.The Alizarin red staining results showed the number of mineralized nodules and calcium deposition of the MSCs in 50% EPCs-CM group and 100% EPCs-CM group were higher than those in control group after cultured for 21 d(P<0.05).ConclusionThe method of differential adhesion can simultaneously isolate the MSCs and EPCs.EPCs-CM can promote the proliferation and osteogenic differentiation of the MSCs.

mesenchymal stem cells;endothelial progenitor cells;conditioned medium;cell proliferation;osteogenic differentiation

1671-587Ⅹ(2015)02-0218-07

10.13481/j.1671-587x.20150203

2014-08-19

国家自然科学基金资助课题(31271458)；人力资源和社会保障部留学回国人员科技活动项目资助课题(RSLX201201)；兵团科技援疆项目资助课题(2011AB034，2014AB047)

冯文磊(1987-)，男，河南省商丘市人，在读医学硕士,主要从事干细胞与再生医学基础方面的研究。

吴向未，教授，博士研究生导师(Tel:0993-2859449， E-mail：wxwshz@126.com)

R683

A