异氟醚对Aβ25-35诱导大鼠PC12细胞氧化应激损伤的影响及海藻糖的保护作用

徐姗姗，朴美花，王艳姝，刘　楠，裴爱月，冯春生

(吉林大学第一医院麻醉科，吉林 长春 130021)

异氟醚对Aβ25-35诱导大鼠PC12细胞氧化应激损伤的影响及海藻糖的保护作用

徐姗姗，朴美花，王艳姝，刘楠，裴爱月，冯春生

(吉林大学第一医院麻醉科，吉林 长春 130021)

目的：探讨吸入麻醉药异氟醚对β淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)诱导大鼠PC12细胞氧化应激损伤的影响，阐明海藻糖对其可能的预防及保护作用。方法：将大鼠PC12细胞随机分为正常对照组(Control组)、异氟醚组(Iso组)、Aβ25-35组(Aβ组)、异氟醚+Aβ25-35组(Iso+Aβ组)、异氟醚+Aβ25-35+海藻糖组(Iso+Aβ+Tre组)和海藻糖组(Tre组)。正常对照组，PC12细胞给予正常细胞培养基培养；Iso组，PC12细胞给予2%异氟醚；Aβ组，PC12细胞给予10 μmol·L-1Aβ25-35；Iso+Aβ组，PC12细胞给予2%异氟醚和10 μmol·L-1Aβ 25-35；Iso+Aβ+Tre组，PC12细胞给予2%异氟醚、10 μmol·L-1Aβ25-35和200 mmol·L-1海藻糖；Tre组，PC12细胞给予200 mmol·L-1海藻糖。采用MTT法检测细胞存活率；Hoechst 33342荧光染色检测细胞凋亡率；二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)荧光法检测细胞中活性氧(ROS)水平；化学发光法测定细胞中丙二醛(MDA)水平，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及过氧化氢酶(CAT)活性。结果：与正常对照组比较，Iso组、Aβ组和Iso+Aβ组PC12细胞凋亡率明显升高(P<0.05或P<0.01)，细胞存活率明显降低(P<0.05或P<0.01)，细胞中ROS和MDA水平(P<0.05或P<0.01)明显升高，细胞中SOD、GSH-Px和CAT活性明显降低(P<0.05或P<0.01)；与Iso和Aβ组比较，Iso+Aβ组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，但细胞存活率明显降低(P<0.05)，细胞中ROS、MDA水平(P<0.05)明显升高，细胞中SOD和GSH-Px和CAT活性明显降低(P<0.05)；与Iso+Aβ组比较，Iso+Aβ+Tre组细胞凋亡率(P<0.05)明显降低，细胞存活率明显升高(P<0.05)，细胞中ROS和MDA水平明显降低(P<0.05)，细胞中SOD、GSH-Px和CAT活性明显升高(P<0.05)。结论：吸入麻醉药异氟醚能够加剧Aβ25-35诱导PC12细胞氧化应激损伤和细胞凋亡，海藻糖能够通过抗氧化和抗凋亡作用拮抗异氟醚的细胞毒性。

异氟醚；阿尔茨海默病；PC12细胞；氧化应激；细胞凋亡；海藻糖

目前全世界每年有800万阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)患者经历全身麻醉。动物实验和临床研究[1-2]表明：全身麻醉能够增加AD发病的风险，加重AD的神经病理改变。研究[3-4]显示：氧化应激和自由基损伤与AD神经元凋亡有密切关联。有研究[1,5]证实：临床相关浓度的吸入麻醉药异氟醚能够诱导神经细胞凋亡，加剧AD神经病理进程，但其机制是否与氧化应激损伤有关还有待进一步研究。海藻糖(trehalose)是一种天然的细胞保护剂，具有抗氧化应激损伤能力，可以保护细胞对抗多种有害刺激和损伤(如脱水、氧化应激和高温等)[6-7]，但海藻糖能否预防和(或)减轻吸入麻醉药异氟醚对AD的神经毒性作用尚不清楚。因此，本研究拟应用β淀粉样蛋白(beta-amyloid protein,Aβ)25-35损伤的大鼠PC12细胞体外AD模型，探讨异氟醚对Aβ诱导大鼠PC12细胞氧化应激损伤的影响及海藻糖的保护作用。

1　材料与方法

1.1细胞和主要试剂大鼠PC12细胞系由中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所提供。高糖DMEM培养基、链霉素、谷氨酰胺、青霉素、磷酸缓冲液(PBS)、胎牛血清、胰蛋白酶和多聚赖氨酸均购自美国Gibco公司；Aβ 25-35、海藻糖、二甲基亚砜(DMSO)、二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)、Hoechst 33342和四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Sigma公司；异氟醚购于美国雅培公司；丙二醛(malondialdehyd,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase,GSH-Px)和过氧化氢酶(catalase,CAT)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司。

1.2PC12细胞培养将PC12细胞置于含100 U·mL-1青霉素、10%热灭活胎牛血清、100 mg·L-1链霉素和1%谷氨酰胺的DMEM高糖培养液中，于5%CO2、37℃恒温细胞培养箱中进行培养，培养2 ～ 3 d更换细胞培养液1次，当PC12细胞生长至70%～80%融合时，给予0.25%胰蛋白酶进行消化，细胞传代培养。

1.3聚集态Aβ25-35的制备应用无菌去离子水溶解Aβ25-35，配制浓度为1 mmol·L-1的Aβ25-35母液，于-80℃冰箱保存。使用前先将Aβ25-35置于37℃温箱中孵育5 ～ 7 d使Aβ 25-35达到聚集状态，应用细胞培养液稀释至其终浓度为10 μmol·L-1，保存于4℃冰箱待用。

1.4细胞分组及处理PC12细胞培养至对数生长期，分别以1.0×105、5.0×104和1.0 ×104mL-1接种于6孔、24孔和96孔细胞培养板，每组6孔。细胞加入含10%胎牛热灭活血清的细胞培养液继续培养24 h后，去除原细胞培养液，重新加入含1%热灭活胎牛血清的细胞培养液2 h后，随机将PC12细胞分为正常对照组(Control组)、异氟醚组(Iso组)、Aβ25-35组(Aβ组)、异氟醚+Aβ25-35组(Iso+Aβ组)、异氟醚+Aβ25-35+海藻糖组(Iso+Aβ+Tre组)和海藻糖组(Tre组)。正常对照组：PC12细胞加入DMEM培养液；异氟醚组：将细胞培养板置于特定的密闭容器中，容器连接麻醉机，持续通入流量为2 L·min-1的O2，并通过吸入麻醉药挥发罐给予2%异氟醚处理，持续作用6 h；Aβ组：PC12细胞加入Aβ 25-35至终浓度为10 μmol·L-1；Iso+Aβ组：PC12细胞加入10 μmol·L-1Aβ的同时给予2%异氟醚作用6 h；Iso+Aβ+Tre组：PC12细胞预先给予终浓度为200 mmol·L-1海藻糖24 h后，加入10 μmol·L-1Aβ25-35并同时给予2%异氟醚作用6 h；Tre组：PC12细胞加入终浓度为200 mmol·L-1的海藻糖。

1.5PC12细胞凋亡率的检测应用Hoechst 33342染色法检测各组细胞凋亡率[8]。PC12细胞接种于24孔细胞培养板中，按实验要求给予药物作用24 h后，细胞经PBS清洗3次，加入终浓度为10 mg·L-1的Hoechst33342溶液，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育10 min，PBS清洗3次，细胞经1 000×g 离心5 min，去掉上清后，应用荧光显微镜检测细胞核凋亡形态学。正常PC12细胞经Hoechst33342荧光染色为蓝色均匀荧光，凋亡细胞的细胞核呈现颗粒分叶状或缩小凝固状蓝色明亮荧光。显微镜下任意选取6个视野计数凋亡细胞，每个视野相应的细胞数大于400个。细胞凋亡率=计数凋亡细胞数/计数细胞总数× 100%。

1.6PC12细胞存活率的检测应用MTT法检测PC12细胞存活率[8]。细胞接种于96孔细胞培养板内，按实验要求给予药物作用24 h后，细胞经PBS清洗3次，每孔加入MTT溶液15 μL，在37℃、5%CO2培养箱中孵育4 h后去除孔内上清液，每孔加入150 μL DMSO溶液，振荡10 min，应用酶标仪在激发波长570 nm处测定各孔吸光度(A)值。PC12细胞存活率=实验组A值/对照组A值×100%。

1.7PC21细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平测定PC12细胞接种于6孔细胞培养板中，按实验要求各组细胞进行相应药物处理24 h后，细胞经PBS清洗3次，加入终浓度为10 μmol·L-1DCFH-DA荧光探针溶液，在37℃、5%CO2培养箱中孵育20 min，PBS清洗3次。细胞经1 000×g离心5 min，去掉上清后，应用荧光分光光度计在激发波长488 nm、发射波长525 nm处检测细胞内DCFH荧光强度。细胞中ROS水平以DCFH平均荧光强度表示。

1.8PC12细胞中MDA水平，SOD、GSH-Px和CAT活性检测PC12细胞接种于6孔细胞培养板内，进行相应药物处理24 h后，细胞经PBS清洗3次，离心收集细胞，加入细胞裂解液，提取上清待测，采用BCA试剂盒进行蛋白定量。PC12细胞中MDA水平和SOD、GSH-Px及CAT活性的测定操作均按照试剂盒说明书进行。MDA水平测定采用硫代巴比妥酸法；SOD活性测定采用黄嘌呤氧化酶法，以每毫克蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达到50%时所对应的SOD量为一个SOD活性单位(U)。采用荧光分光光度计测定各管A值，计算MDA水平，SOD、GSH-Px及CAT活性。

2　结　果

2.1各组PC12细胞存活率正常对照组PC12细胞存活率为98.1%±2.6%；与正常对照组比较，Iso组、Aβ组和Iso+Aβ组PC12细胞存活率(86.7%±9.5% 、82.8%±11.8%和69.4%±8.3%)降低(P<0.05或P<0.01)；与Iso组和Aβ组比较，Iso+Aβ组PC12细胞存活率明显降低(P<0.05)；Iso+Aβ+Tre组PC12细胞存活率(91.2% 6.3%)高于Iso+Aβ组(P<0.05)。

2.2各组PC12细胞凋亡率与正常对照组(1.2%±0.2%)比较，Iso组、Aβ组和Iso+Aβ组PC12细胞凋亡率(11.12%±0.27%、16.21%±0.37%和28.74%±0.85%)明显升高(P<0.05或P<0.01)；与Iso组和Aβ组比较，Iso+Aβ组PC12细胞凋亡率明显升高(P<0.05)；Iso+Aβ+Tre组PC12细胞凋亡率(7.32%±0.22%)低于Iso+Aβ组(P<0.05)。见图1(插页一)。

2.3各组PC12细胞中ROS水平与正常对照组(165)比较，Iso组(425)、Aβ组(618)和Iso+Aβ组(921)PC12细胞中ROS水平明显升高；与Iso组和Aβ组比较，Iso+Aβ组PC12细胞中ROS水平明显升高；与Iso+Aβ组比较，Iso+Aβ+Tre组PC12细胞中ROS水平(223)降低。

2.4各组PC12细胞中MDA水平和SOD、GSH-Px及CAT活性与正常对照组比较，Iso组、Aβ组和Iso+Aβ组PC12细胞中MDA水平明显升高，SOD、GSH-Px和CAT活性明显降低(P<0.05或P<0.01)；与Iso组和Aβ组比较，Iso+Aβ组PC12细胞中MDA水平明显升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px和CAT活性明显降低(P<0.05)；与Iso+Aβ组比较，Iso+Aβ+Tre组和Tre组PC12细胞中MDA水平降低，SOD、GSH-Px和CAT活性升高(P<0.05)。见表1。

表1　各组PC12细胞中MDA水平和SOD、GSH-Px及CAT活性

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group;△P<0.05 compared with Aβ group;#P<0.05 compared with Iso group;▲P<0.05 compared with Iso+Aβ group.

3　讨　论

氧化应激与AD发病有密切关联[9]。研究[10]显示:Aβ蛋白的异常聚集、ROS的积聚、线粒体的损伤是AD的重要病理因素，其相互影响，共同促进AD病理进程的进展。线粒体作为细胞能量的主要来源，在氧化磷酸化的同时产生大量的副产物ROS。蓄积的ROS不仅氧化细胞内的DNA、脂质和蛋白质，还能促进蛋白质聚集(Aβ蛋白聚集)。Aβ在聚集过程可以产生ROS，加重氧化应激反应，而Aβ的聚集还能直接损伤线粒体，生成过多的ROS[11]。大量的Aβ、ROS和Ca2+进入线粒体，能够引起线粒体肿胀和膜电位消失，能量生成减少，ROS生成进一步增加，最后引起线粒体破裂，细胞色素C的释放和凋亡因子的激活，导致神经元凋亡。MDA是氧自由基氧化生物膜中的不饱和脂肪酸而形成的脂质过氧化物的代谢产物，MDA 水平能反应出机体氧化应激的程度。SOD、GSH-Px和CAT是体内重要的抗氧化酶类，SOD能清除超氧阴离子，而GSH-Px和CAT能特异性地分解SOD，GSH-Px和CAT活性高低反应了机体清除氧自由基能力。本研究结果显示：经10 μmol·L-1Aβ25-35处理PC12细胞24 h后，细胞凋亡率明显增加，细胞存活率明显降低，细胞中ROS水平明显升高，细胞中MDA水平明显升高，细胞SOD、GSH-Px、CAT活性明显降低，表明Aβ25-35能够引起大鼠PC12细胞氧化应激损伤和细胞凋亡；给予临床相关浓度的异氟醚处理PC12细胞24 h后，Iso组细胞凋亡率明显增加，存活率明显降低，细胞中ROS水平明显升高，细胞中MDA水平明显升高，细胞中SOD、GSH-Px和CAT活性明显降低，表明异氟醚也能引起大鼠PC12细胞氧化应激损伤和细胞凋亡；与Aβ组比较，Iso+Aβ组PC12细胞同时应用2%异氟醚和10 μmol·L-1Aβ25-35处理后，细胞凋亡率进一步增加，细胞存活率进一步降低，细胞中ROS和MDA水平进一步升高，细胞中SOD、GSH-Px和CAT活性进一步降低，提示吸入麻醉药异氟醚能够明显加剧Aβ25-35诱导的大鼠PC12细胞氧化应激损伤和凋亡。体外培养的细胞研究[12]结果表明：临床相关浓度的异氟醚能降低细胞存活率，诱导Caspase-3活化、ROS积聚和线粒体功能障碍，减少ATP生成。在体外培养的神经元和正常小鼠脑内研究[5,13]结果显示：异氟醚能增加Aβ的生成，促进ROS产生和细胞色素C的释放，降低Bcl-2表达，增加Bax表达，诱导Caspase-3活化和凋亡[5,13]，与本研究结果一致。

海藻糖(C12H22O11)由2个葡萄糖分子以α,α,1,1-糖苷键构成，是一种化学性质稳定，无毒性的天然非还原性双糖，在自然界中广泛存在于多种植物和非哺乳动物体内。海藻糖是一种天然的细胞保护剂，可以保护细胞对抗多种有害刺激和损伤(如脱水、氧化应激和高温等)[6-7]，还能保存蛋白质药物、人类组织和细胞活性。动物实验研究[14]表明：海藻糖能改善转基因AD鼠的行为学缺陷程度，减少脑内磷酸化Tau和Aβ蛋白聚集，还能够抑制亨廷顿病转基因鼠脑内多聚谷酰胺的形成，改善其运动功能，并延长其寿命[15]。Yang等[16]发现：脑内移植神经干细胞复合海藻糖能够减轻转基因鼠亨廷顿病模型的神经病理过程。本研究结果显示：与Iso+Aβ组比较，Iso+Aβ+Tre组和Tre组PC12细胞存活率明显升高，细胞凋亡率明显降低，细胞中MDA水平明显降低，细胞中SOD、GSH-Px和CAT活性明显升高，表明给予海藻糖能够明显减轻异氟醚诱导AD细胞模型氧化应激损伤和细胞凋亡，提示海藻糖能够拮抗吸入麻醉药异氟醚对AD的细胞毒性。动物实验研究[17]表明：给予抗氧化剂能够阻止转基因AD鼠的空间记忆功能的丧失，保护蛋白质不受氧化应激性损伤，减少脑内Aβ蛋白聚集。海藻糖已经被证实是一种有效的天然抗氧化剂。很多研究[6,18]表明：海藻糖能够保护细胞对抗氧化应激损伤。研究[19-20]显示:细胞内海藻糖能够对抗活性氧的损伤，保护细胞和蛋白质的活性，还能够明显增强真菌抵抗H2O2引起的氧化应激损伤的能力。Bleoanca等[21-23]发现:海藻糖还能降低由脂质过氧化损伤介导的氧化应激反应，与本研究结果一致。

综上所述，异氟醚能够促进Aβ25-35诱导大鼠PC12细胞氧化应激损伤和细胞凋亡，海藻糖能够通过抗氧化和抗凋亡作用来拮抗异氟醚的细胞毒性。

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Effect of isoflurane on oxidative stress injury induced by Aβ25-35 and protective effects of trehalose in PC12 cells of rats

XU Shanshan,PIAO Meihua,WANG Yanshu,LIU Nan,PEI Aiyue,FENG Chunsheng

(Department of Anesthesiology,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo explore the effect of isoflurane on the oxidative stress injury induced by beta-amyloid protein (Aβ) 25-35 in PC12 cells of the rats,and to clarify the possible protective effects of trehalose on this injury.MethodsThe PC12 cells of rats were randomly divided into normal control group (Control group,treated with normal cell culture medium),isoflurane group (Iso group,treated with 2% isoflurane),Aβ25-35 group(Aβ group,treated with 10 μmol·L-1Aβ25-35),isoflurane + Aβ25-35 group (Iso+Aβ group,treated with 2% isoflurane and 10 μmol·L-1Aβ25-35),isoflurane + Aβ25-35 + trehalose group (Iso+Aβ+Tre group,treated with 2% isoflurane,10 μmol·L-1Aβ25-35 and 200 mmol·L-1trehalose),and trehalose group (Tre group,treated with 200 mmol·L-1trehalose).The survival rates of the PC12 cells were detected by MTT assay;the apoptotic rates of the PC12 cells in various groups were determined by Hoechst 33342 staining;the levels of intracellular reactive oxygen species (ROS) of the PC12 cells were measured by DCFH-DA fluorescence assay;the levels of malondialdehyd (MDA) and the activities of superoxide dismutase (SOD),glutathion peroxidase (GSH-Px), and catalase (CAT) of the PC12 cells were detected by commercial kits.ResultsCompared with control group,the apoptotic rates of the cells were increased and the survival rates were decreased,and the levels of ROS and MDA and the activities of SOD,GSH-Px, and CAT in the PC12 cells were significantly decreased (P<0.05 orP<0.01) in Aβ group,Iso group and Iso+Aβ group.Compared with Iso group or Aβ group,the apoptotic rates were increased,the survival rates were decreased,the levels of ROS and MDA were increased,and the activities of SOD,GSH-Px,and CAT in the PC12 cells in Iso+Aβ group were decreased(P<0.05).Compared with Iso+Aβ group,the survival rates were increased and the apoptotic rates were decreased and the levels of ROS and MDA were decreased,and the activities of SOD,GSH-Px,and CAT in the PC12 cells in Iso+Aβ+Tre group were increased (P<0.05).ConclusionIsoflurane could aggravate the oxidative stress injury and the apoptosis induced by Aβ25-35 in the PC12 cells of the rats,and trehalose could alleviate the cytotoxicity of isoflurane via inhibition of oxidation and apoptosis.

isoflurane;Alzheimer’s disease;PC12 cells;oxidative stress;apoptosis;trehalose

1671-587Ⅹ(2015)02-0207-06

10.13481/j.1671-587x.20150201

2014-10-10

国家自然科学基金资助课题(81141065,81271215)

徐姗姗(1982-)，女，吉林省长春市人，在读医学硕士，主要从事全身麻醉药物对阿尔茨海默病发病机制影响的研究。

冯春生，副教授，硕士研究生导师 (Tel：0431-88782955，E-mail：fcs1971@hotmail.com)

R614.24

A

网络出版时间: 2015-03-10 11:34

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/22.1342.r.20150310.1134.002.html