动脉灌注化疗对大鼠脑胶质瘤的治疗作用及其机制

王昆鹏，赵文清，王维兴，呼铁民，康进生，孙　鑫，鞠智卿

(1.承德医学院附属医院神经外科，河北 承德 067000；2.河北医科大学研究生院， 河北 石家庄 050017;3.河北省人民医院神经外科，河北 石家庄 050051；4.围场满族蒙古族自治县县医院神经外科，河北 承德 068450；5. 承德医学院附属医院康复科，河北 承德 067000)

动脉灌注化疗对大鼠脑胶质瘤的治疗作用及其机制

王昆鹏1,2，赵文清2,3，王维兴1，呼铁民1，康进生3，孙鑫4，鞠智卿5

(1.承德医学院附属医院神经外科，河北 承德 067000；2.河北医科大学研究生院， 河北 石家庄 050017;3.河北省人民医院神经外科，河北 石家庄 050051；4.围场满族蒙古族自治县县医院神经外科，河北 承德 068450；5. 承德医学院附属医院康复科，河北 承德 067000)

目的:探讨动脉灌注化疗对大鼠脑胶质瘤的治疗作用及其机制，为临床应用提供依据。方法:24只脑胶质瘤模型大鼠随机分为动脉组、静脉组和对照组，每组8只，分别通过大鼠尾静脉(静脉组)及颈动脉(动脉组)给予化疗药物VM-26，对照组大鼠给予生理盐水。观察各组大鼠肿瘤体积和生存期；给予不同途径治疗1周后处死大鼠，采用PCR法观察大鼠肿瘤细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)和拓扑异构酶Ⅱ(TOPOⅡ)mRNA的表达水平；免疫组织化学法检测大鼠肿瘤细胞中PCNA的阳性细胞数；流式细胞术检测大鼠肿瘤细胞凋亡率。结果: 动脉组大鼠经治疗后肿瘤生长速度最慢，静脉组其次，对照组最快，动脉组大鼠肿瘤体积小于静脉和对照组(P<0.05)，静脉组大鼠肿瘤体积小于对照组(P<0.05)。与对照组比较，动脉组和静脉组大鼠生存期延长(P<0.05)；动脉组大鼠生存期长于静脉组，但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。动脉组大鼠肿瘤组织中PCNA及TOPOⅡ mRNA表达水平低于对照组和静脉组(P<0.05)，静脉组大鼠肿瘤组织中PCNA及TOPOⅡ mRNA表达水平低于对照组(P<0.05)。动脉组大鼠肿瘤组织中PCNA阳性细胞数低于静脉组和对照组(P<0.05)。动脉组大鼠肿瘤细胞凋亡率高于静脉组和对照组(P<0.05)。结论：动脉灌注途径化疗使肿瘤细胞增殖速度减慢，肿瘤细胞凋亡明显增多，能更有效控制肿瘤生长。

脑胶质瘤；动脉灌注；细胞核增殖抗原；拓扑异构酶-Ⅱ；细胞凋亡；化学疗法

脑胶质瘤是神经系统常见的一类肿瘤，占颅内肿瘤33.3%～58.9%。由于脑胶质瘤呈浸润性生长，复发率高，因此一直是困扰医学界的一大难题。目前神经外科学界多采用以手术为主，结合放、化疗的综合治疗。在化疗药物的选择上，主要采用较易透过血脑屏障、肿瘤靶向治疗效果较好、有多种抗肿瘤机制且对全身毒副作用较小的药物。本研究所采用的VM-26是鬼臼毒的半合成衍生物,有高度脂溶性、易通过血脑屏障等特点，可抑制增殖期肿瘤细胞增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达，并通过抑制细胞分裂周期中拓扑异构酶Ⅱ(topoisomeraseⅡ,TOPOⅡ)的表达诱导肿瘤细胞凋亡，最终达到抗肿瘤的目的。在化疗途径的选择上，如何使药物更好地透过血脑屏障，最大程度发挥药物抑制肿瘤的作用，成为研究者关注的焦点。目前，对脑胶质瘤的化疗主要采用静脉途径，其疗效已得到临床上的证实，而对于动脉灌注治疗脑胶质瘤国外已有报道，但国内报道较少。本实验观察动脉灌注途径化疗治疗脑胶质瘤的效果并探讨其作用机制，为胶质瘤的临床治疗提供新的途径。

1　材料与方法

1.1实验动物、细胞、主要试剂和仪器24只雄性SD大鼠,体质量250～300 g,由河北医科大学动物中心提供(动物合格证号：805927)。鼠脑胶质瘤细胞9L由河北医科大学第四医院科研中心提供。卫萌(河北医科大学第四医院提供)，RPMI-1640干粉(美国Sigma公司 )，鼠PCNA抗体(博海生物公司)。CO2恒温培养箱(美国Sheldon公司)，超净工作台 (苏州净化设备集团 )，倒置显微镜(日本Olympus公司),GeneAmp 9600型PCR仪 (美国PE公司)。

1.2细胞培养细胞复苏成功后，将9L细胞置于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基中(含青霉素100 U·mL-1和链霉素100 U·mL-1)，置于37℃、5%CO2条件下培养，观察细胞生长状况，常规传代培养，取对数生长期细胞，由0.25%胰酶消化制成细胞悬液，显微镜下计数板计数，调整细胞浓度为1×106～1×107L-1备用。

1.3大鼠脑胶质瘤模型制备24只健康雄性大鼠，经10%水合氯醛(3.5g·kg-1)腹腔注射麻醉后，固定于大鼠脑立体定向仪头架上。去毛，常规消毒术区，剪开头皮并逐层分离，暴露颅骨标志，选取颅内右侧尾状核部位钻孔，接种9L细胞，其坐标为大囟中点前1.0 mm，矢状缝右旁开3.0～3.5 mm，硬膜下5.0 mm。用大鼠脑立体定向仪按坐标定位，用微量注射器插入脑组织6 mm后退出1 mm，将10 μL细胞悬液缓慢注入靶区，接种时应缓慢，一般10 min内注射完毕。接种完毕后，迅速用骨腊封闭骨孔，缝合皮肤。术后10 d后行MRI检查，发现目标部位有肿瘤形成即确认模型制备成功。

1.4实验动物分组及治疗确定成瘤的大鼠即为荷瘤大鼠，将24只荷瘤大鼠随机分为动脉组、静脉组和对照组，每组8只。3组动物进行治疗前均给予静脉快速输入体积分数为20%甘露醇20 mL，辅以地塞米松等药物,以开放血脑屏障增加药物作用浓度并可避免药物对灌注区域周围脑组织的刺激,从而缓解和消除局部的毒性反应。将50 mg VM-26溶于50 mL生理盐水，大鼠体表面积= 0.876 2+0.698 1×体质量(g)，按60 mg·m-2给予大鼠VM-26。动脉组：荷瘤大鼠经10%水合氯醛(3.5 g·kg-1)腹腔注射麻醉后，针头固定于操作板上，沿颈部正中切开皮肤，在气管右侧找到颈动脉，行颈动脉插管给予化疗药物，以1～2 mL·min-1速度灌注,在操作中注意动作要轻柔、熟练。缝合大鼠皮肤，观察大鼠生长状态。静脉组：麻醉同上，对荷瘤大鼠经尾静脉输入VM-26；对照组：荷瘤大鼠经颈动脉注入同等剂量生理盐水。

1.5各组大鼠肿瘤体积和生存期检测①肿瘤体积：按分组情况给予化疗药物，化疗后1周再次行MRI检查，观察各组大鼠肿瘤体积；②大鼠生存期：观察各组大鼠生存状况，包括生活习性的改变、饮食和有无癫痫发作等。每组大鼠各留3只不处死，观察生存期。

1.6PCR法检测大鼠脑胶质瘤组织中PCNA及TOPOⅡ mRNA表达水平将完整性合格的RNA用无菌离子水稀释至适当倍数，在紫外线分光光度仪上测量260和280 nm波长处的吸光度(A)值，A260/A280比值大于1.7说明RNA纯度较高，可用于进一步分析，RNA水平(mg·L-1)= A260×稀释倍数。PCNA引物序列：上游引物5′-GACACATACCGCTGCGATCG-3′，长度为20 bp，下游引物5′-TCACCACAGCATCTCCAATAT-3′，长度为21 bp，扩增后片段长度为307 bp；PCNA扩增条件：94℃、1 min， 94℃、45 s，退火温度51℃、45 s，72℃、45 s,共35个循环；72℃延伸5 min。TOPOⅡ引物序列：上游引物5′-CCTTCCAGCCTGACTTATCT-3′，长度为20 bp，下游引物5′-ACACCTCCCTTGTTCTTCTT-3′，长度为20 bp，扩增后片段长度为394 bp。TOPOⅡ扩增94℃、1 min， 94℃、45 s，退火温度51℃、45 s，72℃、45 s(35个循环)，72℃ 延伸5 min，扩增目的片段长度为394 bp；同时扩增鼠β-actin作为内参照，保证每次实验的相对可比性。取RT-PCR产物4 μL，加缓冲液1 μL，在1.5%琼脂糖凝胶(含EB)上电泳，80 V、45 min，采用UVP凝胶图像成像系统拍摄打印实验结果，采用凝胶图像分析系统(Gel-Pro Analyzer Version 3.0)分析结果。3组动物经化疗后1周，分别处死，并在接种部位取材，将标本分为3份，分别用体积分数为4%多聚甲醛、体积分数为75%乙醇和液氮固定保存。半定量PCR法分析大鼠脑胶质瘤组织中PCNA和TOPO-ⅡmRNA表达水平。

1.7免疫组织化学方法观察大鼠脑胶质瘤组织中PCNA阳性细胞数以细胞核染色棕黄/棕褐色>10%判为阳性。在低倍镜下确定PCNA阳性细胞密度最高区域,然后在高倍视野(×400)下计数500～1 500个细胞(根据肿瘤细胞的密度而定),同时计数出PCNA阳性细胞数(血管内皮细胞和非肿瘤细胞不予计数)。

1.8流式细胞术测定大鼠肿瘤细胞凋亡率各组大鼠分别取材后，取部分瘤组织，用乙醇固定，研磨后制成单细胞悬液，流式细胞术检测各组肿瘤细胞凋亡率，即凋亡细胞占细胞总数的百分比。

2　结　果

2.1各组大鼠肿瘤体积动脉组大鼠肿瘤体积为(5.91±0.16)mm3，静脉组大鼠肿瘤体积为(7.69±0.54) mm3，对照组大鼠肿瘤体积为(9.05±0.50) mm3。动脉组大鼠的肿瘤体积明显小于静脉组和对照组(P<0.05)；静脉组大鼠的肿瘤体积明显小于对照组(P<0.05)。对照组大鼠肿瘤增长速度最快，静脉组次之，动脉组最慢。各组大鼠脑胶质瘤MRI检查结果见图1。

2.2各组大鼠生存期动脉组、静脉组和对照组大鼠生存期分别为(27.33±3.22)、(21.00±3.61)和(16.67±4.62)d。与对照组比较，动脉组大鼠生存期延长(P<0.05)，静脉组大鼠生存期与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；动脉组大鼠生存期长于静脉组，但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3各组大鼠胶质瘤组织中PCNA和TOPOⅡmRNA表达水平PCR检测结果显示 ：动脉组大鼠PCNA mRNA表达水平(0.129±0.046)最低，其次是静脉组(0.311±0.006)，对照组(0.473±0.003)最高,3组大鼠胶质瘤组织中PCNA mRNA表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。动脉组大鼠TOPOⅡ mRNA表达水平(0.105±0.002)最低，其次是静脉组(0.271±0.006)，对照组(0.390±80.005)最高,3组大鼠胶质瘤组织中TOPOⅡ mRNA 表达水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。电泳图示动脉组PCNA和TOPOⅡ所在条带较静脉组亮度降低，表达较少，静脉组PCNA和TOPOⅡ表达较对照组少。见图2。

A: Control group; B: Vein group; C: Artery group.

2.4各组大鼠脑胶质瘤组织中PCNA阳性细胞数动脉组大鼠肿瘤组织中PCNA阳性细胞数为(0.43±0.09)个，静脉组为(0.59±0.11)个，对照组为(0.87±0.14)个。动脉组大鼠肿瘤组织中PCNA阳性细胞数最少，静脉组次之，对照组最多，3组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3(插页五)。

2.5各组大鼠肿瘤细胞凋亡率动脉组大鼠肿瘤细胞凋亡率(8.95% ± 1.03%)最高，其次为静脉组(2.87% ± 0.47%)，对照组(1.03% ± 0.30%)最低。各组间细胞凋亡率比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

3　讨　论

肿瘤的形成起源于细胞的癌基因和抑癌基因的改变，肿瘤的发展是诸多癌基因和抑癌基因受累后作用叠加、肿瘤细胞克隆选择和扩增的最终结果[1-2]。脑胶质瘤由于具有生长迅速、手术难以彻底切除、肿瘤常在短期内复发且伴有恶性转变的特点，成为治疗的难点。化疗药物在控制肿瘤生长、延长患者生存期等方面起重要作用。探讨化疗药物不同的抗肿瘤机制，研究不同途径化疗的效果成为目前胶质瘤研究的热点。

Lane 1-3: Control group; Lane 4-6: Vein group; Lane 7-9: Artery group;M:DL2000 DNA maker.

图2各组大鼠脑胶质瘤组织中PCNA(A)和TOPOⅡ(B)mRNA表达电泳图

Fig.2Electrophoregram of expressions of PCNA (A) and TOPOⅡ(B) mRNA in glioma tissue of rats in various groups

DNA TOPOⅡ是引导DNA复制的多酶体复合物的重要组成部分，其相对分子质量为170 000，基因定位于17q[3-5]，以ATP供能发挥催化活性，在DNA的复制、转录中起着重要作用[6]。TOPOⅡ是一种调节核酸空间结构动态变化、控制核酸生理功能的关键酶，广泛存在于原核生物及真核生物中。有研究[7]显示：TOPOⅡ不仅是某些特异性抗癌药物的靶酶，而且由于其在细胞的快速增殖期表达最高，因此其表达量与细胞增殖潜能成正比。TOPOⅡ是活细胞不可缺少的一种重要核酶,已有研究[8-9]显示：在恶性肿瘤中，TOPOⅡ均有高表达，其表达水平与肿瘤的生物学行为有密切关联，并且对肿瘤患者的预后判断亦有帮助。筛选有效的抗癌药一直是肿瘤防治的重要工作，有效抗癌药应以TOPOⅡ为靶点，选择性抑制增殖期DNA细胞复制，集中杀伤肿瘤细胞，并对肿瘤细胞有较好的选择性。

A: Control group; B: Vein group; C: Artery group; X-axis:Channels; Y-axis：Numbers.

本研究结果显示：在经治疗后VM-26肿瘤细胞中TOPOⅡ表达减少，表明VM-26对胶质瘤细胞TOPOⅡ的表达有抑制作用，从而抑制肿瘤细胞的快速增殖，达到了控制肿瘤生长的目的。

增殖动力学是脑胶质瘤细胞的重要生物学特征之一。化疗药物可通过抑制增殖期肿瘤细胞的分裂增殖来抑制肿瘤细胞的生长，从而达到抗肿瘤生长的目的。近年来随着胶质瘤的生物学研究逐年增多，被认为是肿瘤细胞增殖速度指标的PCNA受到了人们的关注。PCNA在肿瘤细胞复制过程中发挥重要作用，能否在翻译、合成步骤抑制PCNA的生成，减少肿瘤细胞DNA的复制与修复，降低胶质瘤细胞的增殖速度，从而延缓胶质瘤的复发，有待于进一步深入研究。PCNA是一种核蛋白，作为δDNA多聚酶的辅助蛋白,参与DNA的复制、合成和细胞的增殖分裂[10],在细胞周期中起重要的调控作用[11],其表达水平与DNA合成一致：G0/G1期表达水平保持不变，G1期开始增高,S期达到顶峰,G2/M期逐步下降，正常脑组织中PCNA基本不表达，因此PCNA可做为细胞周期的内源性组织标记物，能较好地反映肿瘤细胞的增殖活性[12-13]。

本研究结果显示：应用VM-26对荷瘤大鼠经动脉灌注途径进行治疗后，肿瘤细胞中PCNA表达水平降低，表明肿瘤细胞的增殖受到了抑制，肿瘤的生长也明显受到控制。动脉组和静脉组治疗方法均可抑制大鼠肿瘤细胞快速分裂增殖，动脉组效果优于静脉组。

细胞凋亡(又称细胞程序性死亡)是一种基因控制的细胞自主性的死亡过程，是维持内环境稳定的重要机制之一。化疗药物可通过诱导肿瘤细胞凋亡的途径杀死或抑制肿瘤生长。深入研究细胞凋亡机制将有助于认识胶质瘤发病机制，使胶质瘤的治疗有更广阔的前景。细胞凋亡是细胞通过基因的调控，程序化死亡的过程，诱导细胞发生凋亡，是当前抗肿瘤药物的主要作用机制之一。细胞外部因素则通过信号传递而影响基因表达的变化或新的基因的表达,从而间接地调节细胞凋亡,这些作用的最终结局是激活细胞内DNA酶,引起染色质的异常凝聚和DNA的裂解,从而触发细胞凋亡[14-15]。

本研究结果显示：动脉组和静脉组大鼠肿瘤细胞凋亡率高于对照组，证实了VM-26药物可通过诱导肿瘤细胞凋亡的途径来抑制肿瘤生长，达到抗肿瘤的目的。

胶质瘤呈浸润性生长,手术难以切除其浸润部分,该部分就是肿瘤复发的基础,对这部分肿瘤治疗的是否彻底,决定了其是否复发和复发的速度。血脑屏障开放，通透性增加，可以使化疗药物最大量地进入肿瘤内,达到最好的治疗效果,被认为是目前安全、有效的化学治疗恶性胶质瘤的方法[16]。血脑屏障是脑组织中特有的结构，是由一层紧密相连的上皮结构组成，由于其紧密排列，使相对分子质量较大的水溶性物质难以通过，对脑组织具有保护作用。但也因此阻碍了化疗药物进入脑肿瘤组织中。动脉灌注化疗可以有效地克服口服化疗药的缺点，直接将药物通过导管送到肿瘤的供血血管，不经过体循环和肺循环，减少了药物对全身各系统的毒副作用，提高肿瘤内的药物浓度，提高局部药物作用浓度和患者对化疗的耐受性。研究[17-18]表明：抗肿瘤药物经动脉途径在肿瘤中的摄入量比静脉高10～100倍,药物的半衰期短,故动脉内给药是最佳途径。动脉化疗主要改善了药物的积聚，而并不明显延长药物接触时间，是甚至缩短了化疗时间，说明改善药物的积聚是提高疗效的主要因素。本研究结果显示：动脉组大鼠肿瘤细胞增殖抑制较静脉组更明显，肿瘤细胞凋亡较静脉组明显，表明经动脉灌注途径对大鼠脑胶质瘤进行化疗，能使药物更好地透过血脑屏障，增加化疗药物的疗效，能更有效控制肿瘤的生长。

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Therapeutic effect of arterial infusion chemotherapy on glioma of rats and its mechanism

WANG Kunpeng1,2,ZHAO Wenqing2,3,WANG Weixing1,HU Tiemin1,KANG Jinsheng3, SUN Xin4, JU Zhiqing5

(1.Department of Neurosurgery,Affiliated Hospital,Chengde Medical University,Chengde 067000,China; 2.Graduate School,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China;3. Department of Neurosurgery, Hebei General Hospital,Shijiazhuang 050051,China;4. Department of Neurosurgery,WeiChang Manchu-Mongolian Autonomous County Hospital,Chengde 068450,China;5.Department of Rehabilitation,Affiliated Hospital,Chengde Medical University,Chengde 067000,China)

ObjectiveTo study the therapeutic effect and mechanism of arterial infusion chemotherapy on glioma of the rats,and to provide the basis for clinical application.Methods24 rats were randomly divided into artery group,vein group,and control group; there were 8 rats in each group.The chemotherapy medicine VM-26 were injected through tail intravenous(vein group) and carotid arteries (artery group) into the rats, respectively,and the rats in control group were given normal saline. The tumor size and survival period of the rats were observed;all the rats were killed after giving different treatment for one week, and the expression levels of proliferating cell nuclear antigen(PCNA) and topoisomeraseⅡ(TOPO Ⅱ) in the tumor cells of the rats were detected by PCR method,meanwhile the number of PCNA positive cells in the tumor cells were detected by immunohistochemical method;the apoptotic rates of the tumor cells of the rats were detected by flow cytometry method.ResultsAfter treatment,the tumor growth speed of the rats in artery group was the slowest,which was followed by vein group, and the speed of the rats in control group was the fastest.The tumor size of the rats in artery group was smaller than those in vein and control groups,and the tumor size of the rats in vein group was smaller than that in control group(P<0.05).Compared with control group,the survival period of the rats in artery and vein groups were extended (P<0.05);the survival period of the rats in artery group was longer than that in vein group,but there was no statistically significant difference between two groups (P>0.05).The expression levels of PCNA and TOPO Ⅱ mRNA in the tumor tissue of the rats in artery group were lower than those in vein and control groups (P<0.05),and the expression levels of PCNA and TOPO Ⅱ in the tumor tissue of the rats in vein group were lower than those in control group (P<0.05).The number of PCNA positive cells in the tumor tissue of the the rats in artery group was lower than those in vein group and control group (P<0.05).The apoptotic rate of tumor cells of the rats in artery group was higher than those in vein group and control group(P<0.05).ConclusionThe way of arterial perfusion chemotherapy could make the proliferation of tumor cells slow,and promote the apoptosis of tumor cells obviously,and can control the tumor growth more effectively.

glioma;arterial infusion;proliferating cell nuclear antigen;topoisomerase Ⅱ;apoptosis;chemotherapy

1671-587Ⅹ(2015)02-0327-06

10.13481/j.1671-587x.20150224

2014-09-03

河北省承德市科技局科技支撑计划项目资助课题(201422029)

王昆鹏(1977-)，男，河北省承德市人，主治医师，讲师，医学硕士，主要从事胶质瘤方面的研究。

赵文清，主任医师，教授，博士研究生导师(Tel：0311-85988199，E-mail：2362571843@qq.com)；

孙鑫，主治医师，讲师(Tel:0314-7568061，E-mail：50594366@qq.com)

R361.3

A