铁皮石槲对高铝饲养小鼠生化指标的影响

何胜 林美情 邓晓珍 潘霖 钟绢 宁梅 韦健全 张树球

铁皮石槲对高铝饲养小鼠生化指标的影响

何胜 林美情 邓晓珍 潘霖 钟绢 宁梅 韦健全 张树球

目的 探讨铁皮石槲对高铝饲养小鼠机体生化指标的影响。方法 选用昆明种小鼠30只，分成正常组、模型组、治疗组。除正常组外，用三氯化铝拌饲料饲养小鼠4个月，到结束前3周治疗组用铁皮石槲水提液灌胃21d。用水迷宫方法测定实验前、中、后小鼠的记忆力,实验结束,取静脉血待测；处死动物后,取大脑做成10%脑匀浆待用；测定乙酰胆碱酯酶(AchE)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)、胆固醇(TC)、铝（Al3+）含量等。结果 治疗组、模型组和正常组，脑匀浆AchE依次为（0.59±0.16）、（0.85±0.09）、（0.62±0.13）U/mgprot，模型组与治疗组、正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；脑匀浆铝（Al3+）含量依次为（0.61±0.10）、（0.72±0.06）、（0.59±0.05)μg/mL，模型组与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；脑匀浆MDA含量依次为（2.80±0.52）、（4.51±1.29）、（3.21±1.48)nmol/mL，模型组显著高于其他2组（P＜0.05）；y型水迷宫游水时间，模型组与正常组后期增加显著，差异有统计学意义（P＜0.05），但治疗组差异无统计学意义；GSH-PX、TC各组间比较差异无统计学意义。结论 高铝饲养小鼠脑匀浆和血清铝含量、AchE活力、MDA含量明显升高，铁皮石槲灌服后有明显改善。

铁皮石槲；铝；乙酰胆碱酯酶(AchE)

全球铝的应用极其广泛,人们每天都在接触铝,除生活中常用的铝制品外,企业的排放污染,如电解铝厂等，排放大量的铝和氟等各种元素。自从国外学者发现患者大脑里沉积大量铝以来，人们才开始注意到铝与阿尔茨海默病（Alzheimer,AD）之间的关系，并提出AD的铝中毒学说[1]，用铝来复型AD模型,也有一定的相似性。老年痴呆症（AD）是老年人中常见的疾病，临床表现以认知能力迅速减退和记忆功能丧失为特征，由于发病机理极其复杂，学术界提出了多种学说解释发病机理,尚未阐明清楚，因而尚无根治药物。而铝与AD发病的直接关系尚缺证据,因此,若揭示两者间的直接关系,阐明发病机理,并通过排铝来防治此病,具有重要的实际价值。李韬等[2]曾用铝来复型AD模型，探讨二者间的联系, 但仍有许多问题不清楚,如没有测定大脑中铝的含量与乙酰胆碱酯酶活力之间是否存在内在关系、胆碱能系统相应的大脑细胞形态学是否有损害，尚需要进一步深入探讨。因此，本实验用氯化铝拌饲料喂养小鼠从3个月延长至5个月复制AD模型，用中药铁皮石槲水提液[3]治疗后，测定大脑、血清乙酰胆碱酯酶（AchE）等生化指标和铝含量、大脑病理检查，特别检查与记忆功能密切相关的胆碱能神经中枢皮质和海马形态变化，综合分析，探讨铝对该病的作用机理和评价治疗效果,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试剂 氯化铝、国产分析纯。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)、乙酰胆碱酯酶(AchE)试剂盒、总胆固醇(TC)、甘油三酯（TG），分别购自四川成都迈克科技有限公司,凯基生物公司，南京建成生物工程研究所。

1.2 实验动物及分组 选用昆明种小鼠30只，右江民族医学院动物实验时提供，动物实验许可证SYXK桂2011-0010，动物生产许可证号：SCXK桂2012-0003。鼠龄3个月，雌雄各半。分成正常组、模型组、治疗组。各鼠编号称体质量，分笼喂养，每笼5只，放独立式鼠笼饲养箱内饲养(广东珠海市再鑫仪器有限公司产品),空气过滤净化,室温空调26℃～28℃。均用右江民族医学院动物室提供的混合饲料喂养。饲养1个月,进行水迷宫训练,并进行实验前水迷宫测试。

1.3 治疗药物 中药铁皮石槲(干药材),由广西玉林师范学院赠送。称量,放药锅内加热水提取液-乙醇沉淀-去沉淀-回收乙醇，药液定容为0.2g/mL生药,分装,高压105℃，灭茵30min,取出冷却放冰箱保存。

1.4 AD模型的建立 实验前1个月进行水迷宫测试。第2个月开始造模,除正常组外，其余2组用16g/L浓度的

AlCl3水溶液，按每鼠1.5mL(24mg)/d，拌饲料6～9g/每鼠喂养(动物室提供的标准饲料)，直至实验结束，共120d（4个月）。自由饮用自来水。用水迷宫方法，测定造模前、后和治疗后小鼠的记忆功能[2]。

1.5 治疗方法 造模到100d后，治疗组用铁皮石槲药液灌喂，剂量均为0.1mL/只，每天1次，用蒸馏水稀释至0.2mL后灌喂，直至实验结束（治疗21d）。正常组和模型组用等量的蒸馏水代替，方法相同。

1.6 生化指标的测定 实验结束，从小鼠眼球后静脉取血

0.8 ～1.0mL，离心取血清待用。处死动物，取大脑，用生理盐水洗去血液，并用滤纸吸干水分，称质重，在冰浴下用匀浆器匀浆，用生理盐水稀释成10%的匀浆，离心（3500r/min）10min，取上清液4℃冰箱保存备用。测定脑匀浆乙酰胆碱酯酶（AchE）活力原理，AchE催化乙酰胆碱水解成胆碱和乙酸，胆碱可以与巯基显色剂反应生成TNB（对称三硝基苯）黄色化合物，根据颜色深浅进行比色定量，水解产物胆碱的数量可反映胆碱酯酶的活力。丙二醛(MDA)测定原理，用MDA与硫代巴比妥酸(TBA)缩合,形成红色产物,在532nm有最大吸收峰，比色测定；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)测定原理,利用GSH-PX催化过氧化氢(H2O2)与还原型谷胱甘肽(GSH)反应生成水（H2O）和氧化型谷胱甘肽(GS-SG),测定被消耗的还原型谷胱甘肽(GSH)的量来计算谷胱甘肽过氧化物酶的活力；血清TC（总胆固醇）测定，用

COD-CE-PAP法测定；血清TG用GPO-POD法测定；具体操作按试剂盒说明书。脑匀浆铝含量测定，用原子吸收分光光度计测定（仪器，德国产，型号为：novAA400p，石墨炉）。水迷宫游水时间测定，利用y型水迷宫，开始预先训练5d，每天游水训练

3次，使其熟悉上岸地点（逃命），计算从下水到达上岸地点时间（s）和错误率。统计时把超过10s以上按10s计[4]。

1.7 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行数据处理，计量资料采用“x±s”表示，组间比较采用t检验，两两比较采用

LSD方法检验；计数资料用例数（n）表示，计数资料组间率（%）的比较采用χ2检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑GSH-PX、MDA、Al3+测定结果 结果显示,脑

GSH-PX各组间差异无统计学意义；MDA模型组显著高于其他2组（P＜0.05）；Al3+模型组显著高于正常组（P＜0.01）。见表1。

表1 脑GSH-PX、MDA、Al3+测定结果比较（x±s）

2.2 血清MDA、Al3+、TC测定结果 结果显示,血清MDA模型组显著高于其他2组（P＜0.05）；Al3+模型组显著高于其他2组（P＜0.01）；TC各组间差异无统计学意义。见表2。

表2 血清MDA、Al3+、TC比较（x±s）

2.3 脑、血清AchE、血清TG测定结果 结果显示, 血清AchE正常组显著低于治疗组、模型组（P＜0.01）；脑AchE，模型组显著高于治疗组、正常组（P＜0.01）；血清TG各组间差异无统计学意义。见表3。

表3 脑、血清AchE、血清TG比较（x±s）

2.4 实验前、中、后水迷宫测定结果 结果显示，3组随着实验时间延长，水迷宫时间模型组正常组也显著增加，但治疗组增加不显著。见表4。

表4 实验前、中、后水迷宫游水时间比较（x±s）

3 讨论

血清、脑Al3+模型组均显著高于正常组、治组，长期用氯化铝喂养小鼠，经消化道吸收，可导致其体内铝含量升高，高铝是否可导致老年痴呆症（AD）还未定论，AD的发病原因和机制，目前还不清楚，尚在学说阶段，如遗传学说、神经学说、胆碱能传导学说[5]、中毒学说（铅中毒、铝中毒学说）等，但还缺乏直接的证据。何胜等[6]发现，铝中毒小鼠大脑海马、皮层神经细胞有变性、坏死、凋亡等，可能会导致胆碱能神经传导紊乱，导致AD的发生，或作为发病的其中重要因素之一。

脑AchE，模型组显著高于治疗组、正常组；血清AchE正常组显著低于治疗组、模型组（P＜0.01）。乙酰胆碱是胆碱能神经分泌的神经递质，由乙酰胆碱转移酶催化胆碱和乙酰辅酶A为原料合成[7]，而（AchE）乙酰胆碱酯酶是催化乙酰胆碱分解成乙酸和胆碱的酶，2种酶控制着乙酰胆碱的合成与分解，从而保持平衡，维持胆碱能神经的正常功能，而胆碱能神经目前被认为与记忆功能有关。本实验模型组显著高于治疗组、正常组，说明乙酰胆碱的合成与分解平衡已被打破，记忆功能会出现障碍，而铁皮石槲治疗组接近正常组，说明有所改善或好转[8]。

血清、脑MDA模型组均显著高于其他2组，MDA是不饱和脂肪酸氧化分解产物，其含量与氧化分解有关，反映机体的抗氧化能力，本实验模型组均显著高于其他2组，说明抗氧化能力下降，用铁皮石槲药液灌喂治疗后，情况有所好转。

[1] 张宝第，郭雄．铝致阿尔茨海默病的分子机制[J]．国外医学地理分册，2002,24（2）：57-59.

[2] 李韬，陈菊芳，玉莹，等．中药口服液对铝致老年痴呆症小鼠治疗效果的实验研究[J].工业卫生与职业病,2012,38(4)：224-227.

[3] 黄志海，黄结丽.HPLC测定石槲夜光颗粒中小檗碱含量[J].中国中药杂志，2005,30（14）：1130.

[4] 李海,玉莹,杨彩梅,等．铝致小鼠大脑形态与功能的变化及中药治疗的研究[J]．中国工业医学杂志,2011,24(1)：40-42.

[5] 梁汉周,梁雁,黄波.老年痴呆病的发病机制及临床药物治疗分析[J].当代医学,2013,19(22)：150-151.

[6] 何胜，黄杰林，李佩蕾，等.中药对老年痴呆症小鼠干预作用[J]．中国公共卫生，2014，30（4）：448-450.

[7] 常一丁.中枢胆碱能系统的改变对老年痴呆大鼠行为的影响[J].当代医学,2008,14(11)：27-29.

[8] 余文珍,王晓宁,施红.石槲合剂对衰老糖尿病大鼠胰腺P53表达的影响[J].中华中医药学刊,2012,30(11)：2327-2399.

Objective To investigate the effect of dendrobium officinale on biochemical indices in mice treated with high aluminum feeding. Methods Mice were feeded with AlCl3mix fodder for four months, then the mice in experimental group were treated with dendrobium officinale extract by intragastric administration for 21 days until the end of the experiment. To test the memory of mice by water maze before,in the middle and after experiment. Got venous blood to test at the end of the experiment after four months, took brain and made it into 10% brain homogenate after the mice were killed. To determine acetylcholinesterase (AchE), glutathioneperoxidase (GSH-PX),malondialdehyde (MDA), cholesterol (TC), aluminum (Al3+) content, etc. Results The brain homogenate AchE in experimental group, model group and control group were (0.59±0.16), (0.85±0.09) and (0.62±0.13) U/mgprot respectively, there is statistical difference between model group compare with experimental group and control group (P＜0.01). The aluminum (Al3+) of brain homogenate were (0.61±0.10), (0.72±0.06) and (0.59±0.05) μg/mL respectively, there is significant difference between model group and control group (P＜0.01). MDA of brain homogenate were (2.80±0.52), (4.51±1.29) and (3.21±1.48) nmol/mL respectively, it is higher in model group then other two groups (P＜0.01). It needed much more time in Y water maze swimming in later stage in model and control groups, there is statistical difference (P＜0.05), but no statistical difference in experimental group. No statistical difference of GSH-PX and TC among the three groups . Conclusion Brain homogenate , serum aluminum, AchE activity and MDA content of mice are all increasing significantly after feeded with high alumina , and it will be improved significantly after intake dendrobium officinale extract.

Dendrobium officinale; Aluminum; Acetylcholinesterase (AchE)

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.30.001

广西壮族自治区教育厅科研基金（2013YB188）

广西 533000 右江民族医学院重金属与氟砷毒物研究实验室（何胜 林美情 邓晓珍 潘霖 钟绢 宁梅 韦健全 张树球）

林美情 E-mail:sqzhang224@163.com