人成骨肉瘤MG63紫杉醇耐药细胞系建立及生物学特性研究

吴文欣，李 维

（1.湖南省第二人民医院，长沙410000；2.中南大学湘雅三医院，湖南长沙410000）

人成骨肉瘤MG63紫杉醇耐药细胞系建立及生物学特性研究

吴文欣1，李 维2

（1.湖南省第二人民医院，长沙410000；2.中南大学湘雅三医院，湖南长沙410000）

目的 建立紫杉醇（Taxol）诱导的人成骨肉瘤MG63耐药细胞株亚系MG63/Taxol，并观察其生物学特性。方法 以Taxol为诱导剂，采用大剂量冲击与小剂量维持相结合的方法诱导MG63细胞，建立耐药细胞株亚系MG63/Taxol；集落形成实验检测药物敏感性；光镜观察细胞形态变化，绘制细胞生长曲线；流式细胞术检测细胞周期。结果 （1）经过6个月的诱导，建立了MG63/Taxol细胞株亚系。（2）MG63/Taxol对Taxol的耐药指数为9.50，对顺铂、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶（5-Fu）也产生不同程度交叉耐药。（3）光镜观察可见MG63细胞排列规则，形态呈梭形，大小一致；MG63/Taxol细胞株亚系排列不规则，大小不均，形态呈三角形、多角形及多核现象。（4）细胞生长曲线显示MG63/Taxol细胞较亲本细胞生长缓慢。（5）细胞周期分析显示，MG63/Taxol细胞G0/G1期细胞分布增多，S期细胞分布减少。结论 （1）采用大剂量冲击与小剂量维持相结合的方法诱导建立的人成骨肉瘤多药耐药细胞株亚系MG63/Taxol细胞对顺铂、甲氨蝶呤、5-Fu产生不同程度交叉耐药。（2）MG63/Taxol细胞株亚系细胞形态、细胞生长曲线、细胞周期分布与母系细胞MG63有显著差异。

骨肉瘤；细胞系；细胞凋亡；细胞增殖；药物耐受性；紫杉醇；耐药细胞

骨肉瘤是一种好发于长骨干骺端的恶性肿瘤。1986年Rosen[1]提出新辅助化疗治疗骨肉瘤，随着新辅助化疗的广泛应用，骨肉瘤的5年生存率已达60%以上，但恶性肿瘤化疗后多药耐药的产生仍是影响肿瘤患者化疗疗效和预后的主要因素之一。本研究以人成骨肉瘤细胞株MG63为诱导对象，采用大剂量冲击与小剂量维持相结合的方法诱导建立了人成骨肉瘤多药耐药细胞株亚系MG63/紫杉醇（Taxol），并分析其生物学特性。

1 材料与方法

1.1 材料 人成骨肉瘤细胞株MG63由中南大学湘雅医院惠赠。Taxol（北京四环医药科技股份有限公司）、顺铂（山东齐鲁制药厂）、甲氨蝶呤（江苏恒瑞医药股份有限公司）、5-氟尿嘧啶（5-Fu，天津金耀氨基酸有限公司）、小牛血清（Gibco）、胰蛋白酶（碧云天生物技术研究所）。

1.2 方法

1.2.1 MG63培养与传代 MG63在含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液中培养。每天换液1次。3～5 d长至80%后传代。

1.2.2 MG63多药耐药细胞株亚系的建立 采用大剂量冲击与小剂量维持相结合的方法诱导MG63耐药，取对数生长期MG63细胞接种至10%小牛血清的RPMI-1640培养液，Taxol初始浓度从10 ng/mL开始，药物作用24 h后弃去含药培养液，加入含0.5 ng/mL Taxol的RPMI-1640培养液，继续培养，待其恢复正常生长，消化传代后复用10 ng/mL处理24 h，如此反复换液、传代，逐步提高Taxol浓度间歇诱导，得到能耐受30 ng/mLTaxol浓度的细胞株，命名为MG63/Taxol[2]，并将其维持培养在含1 ng/mL Taxol的完全培养液中。

1.2.3 形态学观察 采用倒置相差显微镜观察对数生长期的MG63和MG63/Taxol细胞形态并照相。

1.2.4 细胞生长曲线测定 将浓度1×104mL-1的MG63和MG63/Taxol细胞分别接种于96孔培养板，每组设3个复孔，24 h后每天以MTT法测定每组光密度（OD）值，连续7 d，绘制生长曲线。

1.2.5 细胞多药耐药性检测 将对数生长期的MG63和MG63/Taxol细胞以1×103mL-1细胞浓度接种于24孔培养板，培养24 h后分别加入等体积不同浓度含Taxol、顺铂、甲氨蝶呤、5-Fu的培养液，每种药物浓度设3个复孔，定为药物组；设无药培养基换液的剩余3孔为对照组，继续培养24 h后弃去含药培养液，加入新鲜培养液，继续培养2～3周，当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS小心浸洗2次，空气干燥。甲醇固定15 min，弃甲醇后空气干燥。用Giemsa染液染色10 min，流水缓慢洗去染液，空气干燥，计算克隆形成数（克隆形成数与活细胞数成正比），取其平均值，计算不同浓度的药物对肿瘤细胞的抑制率=（1-药物组克隆数）/对照组克隆数×100%。采用对数计量直线回归法计算出各种药物对细胞达 50%抑制率时的药物浓度（IC50，g/mL），并计算耐药指数（RI）=IC50耐药细胞/IC50亲代细胞。Taxol诱导6个月，建立了人成骨肉瘤多药耐药细胞株亚系MG63/Taxol，用集落形成实验检测细胞系对抗肿瘤药物的耐药程度变化，以IC50来衡量，

1.2.6 细胞周期 用0.25%胰酶（无EDTA）分别收集耐药细胞诱导期间同步传代的MG63和MG63/Taxol，用预冷PBS洗细胞2次，加入3 mL预冷（-20℃）70%乙醇到细胞沉淀中，于4℃固定过夜，离心收集细胞，以3mL的PBS洗细胞2次，加入500 μL PBS含50 μg/mL溴化乙锭（PI），100 μg/mL核糖核酸酶A（RNase A），0.2%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），4℃避光孵育30 min，流式细胞仪检测细胞周期。

1.3 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞形态变化 光镜下可见MG63和MG63/Taxol细胞均为贴壁生长，MG63排列较规则，形态近似梭形，有少量伪足，核仁清晰、大；MG63/Taxol细胞排列不规则，三角形、多角形多见，形态多样，核仁清晰、大，可见多核现象。见图1。

图1 光镜下MG63和MG63/Taxol细胞形态（200×）

2.2 集落形成实验检测细胞对化疗药物的敏感性

MG63/Taxol对Taxol的RI为9.50，对顺铂、甲氨蝶呤、5-Fu也产生不同程度的交叉耐药，见表1。

表1 集落形成实验检测细胞对化疗药物的敏感性

2.3 细胞生长与增殖 MG63细胞与其多药耐药细胞株亚系MG63/Taxol细胞生长曲线存在差异，MG63/Taxol较MG63生长缓慢，见图2。

图2 MG63及其耐药细胞系MG63/Taxol生长曲线

2.4 MG63及其耐药细胞系MG63/Taxol细胞周期分布

流式细胞仪检测细胞周期结果显示，MG63、MG63/Taxol细胞G0/G1、S期细胞分布比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2、图3。

表2 MG63及其耐药细胞系MG63/Taxol细胞周期分布（±s，%）

表2 MG63及其耐药细胞系MG63/Taxol细胞周期分布（±s，%）

注：与MG63同期比较，aP＜0.05。

细胞MG63 MG63/Taxol G0/G1 G2/M S 49.49±0.58 53.29±1.01a13.97±0.58 13.13±0.57 36.54±0.57 33.57±0.61a

图3 MG63及其耐药细胞系MG63/Taxol细胞周期分布

3 讨 论

恶性肿瘤多药耐药现象是导致化疗失败的主要原因之一，化疗后耐药细胞的产生往往导致原发灶的复发或转移，体外肿瘤多药耐药细胞亚系的建立是研究肿瘤多药耐药性的基础[3-4]。同时也为临床化疗方案的优化提供参考。本研究发现，人成骨肉瘤Taxol耐药细胞MG63/Taxol对顺铂、甲氨蝶呤、5-Fu也产生不同程度的交叉耐药，对顺铂产生低度耐药。该结果提示，2种药物联用治疗肿瘤可以收到更好的效果，同时可以避免肿瘤多药耐药的产生[5]。本研究中构建的骨肉瘤Taxol耐药细胞MG63/Taxol其形态和结构与亲本细胞系相比具有明显差异，这种形态结构的改变可能与耐药产生相适应，但具体机制有待进一步研究。细胞生长曲线结果显示，骨肉瘤Taxol耐药细胞MG63/Taxol耐药细胞较亲本细胞MG63生长缓慢，反映了耐药细胞生长繁殖能力下降，倍增时间延长，这可能是由于细胞在长期药物的刺激下，一些残余的耐药细胞处于休眠期（G0），因而导致细胞对药物的敏感下降，同时增长繁殖能力下降，此现象可能和临床化疗中肿瘤耐药后瘤体迅速增大、局部复发的现象有关。

骨肉瘤的发生、发展、转移与细胞周期异常调控密切相关[6-9]。本研究中应用流式细胞仪检测MG63细胞与其Taxol耐药细胞MG63/Taxol的G0/G1、G2、M期及S期比例。结果显示，G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；研究证明，M、G1、G2期细胞对细胞周期非特异性药物较敏感，而S期细胞对细胞周期特异性药物敏感性最强，而G0期细胞，除周期非特异性药物外，其他化疗药物对其作用不大。G0期细胞对化疗药物具有很大的耐药性。反复经化疗药物刺激后筛选的耐药细胞对周期非特异性药物显示了低抵抗性，而对周期特异性化疗药如5-Fu和甲氨蝶呤产生了较高抵抗性。显然，G0期细胞的存在及其增殖、分裂可能是导致骨肉瘤化疗失败及肿瘤细胞局部复发的主要原因之一[10]，其具体机制有待进一步研究。

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Study on establishment of paclitaxel resistant osteosarcoma cell line MG63/Taxol and its biological characteristics

Wu Wenxin1，Li Wei2
（1.Hunan Provincial Second People′s Hospital，Changsha 410000，China；2.Third Xiangya Hospital of Central South University，Changsha，Hunan 410000，China）

ObjectiveToestablish thepaclitaxel（Taxol0 induced osteosarcoma MG63 drug resistance cell subline（MG63/ Taxol）and to observe its biological characteristics.MethodsPaclitaxel resistant human osteosarcoma cell subline（MG63/Taxol）was established by adopting large dose impact combined with small dose maintenance to induce MG63 cell line with Taxol as the inducer.The sensitivity of chemotherapy drugs for the MG63 and MG63/Taxol cell sublines were measured by the colony formation assay.The cell morphology change was observed through light microscopy.The proliferation ability of cell lines was measured by growth curve.The cell stages were analyzed by flow cytometry.Results（1）Through 6-month induction，paclitaxel resistant osteosarcoma cell subline（MG63/Taxol）was established.（2）The resistant index of MG63/Taxol to Taxol was 10.55.MG63/ Taxol also produced the various degrees of cross resistance to cisplatin，methotrexate and 5-Fu.（3）The cell morphology was observed through light microscopy.The MG63/Taxol cells were regular arranging，spindle shape and size consistent，MG63/Taxol cell subline was irregular arranging，size inconsistent and morphology showed triangle shape，multiangular shape and multi-nucleation.（4）The cell growth cure showed that MG63/Taxol cells grew slowly than the parent cells.（5）The cell cyclical analysis displayed that the distribution of the G0/G1 stage cells was increased，while the S stage cells were decreased.Conclusion（1）A paclitaxel resistant human osteosarcoma cell subline（MG63/Taxol）established by adopting the large dose impact combined with small dose maintenance（MG63）generates the cross resistance to cisplatin，methotrexate and 5-Fu in different degrees.（2）MG63/Taxol cell sublineis significantlydifferent fromtheparent cell MG63intheaspects of cell morphology，cell growthcurveandcell cycledistribution.

Osteosarcoma；Cell line；Apoptosis；Cell proliferation；Drug tolerance；Paclitaxel；Resistant cells

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.15.004

A

1009-5519（2015）15-2259-03

2015-02-17）

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本刊编辑部

湖南省自然科学基金资助项目（11JJ3105）；湖南省科技计划项目（2013FJ3039）。

吴文欣（1980-），男，湖南衡东人，主治医师，主要从事临床脊柱外科工作；E-mail：wuwenxin@126.com。

李维（E-mail：lilywei1979@126.com）。