miR-199a对膀胱癌抑制作用的研究

白羽，臧学丽，张四喜，徐广宇

(1.吉林医药学院 药学院，吉林 吉林 132013；2.长春医学高等专科学校 药学系，吉林 长春 130031；3.吉林大学第一医院 药剂科，吉林 长春 130021；4.北华大学 药学院，吉林 吉林 132013)



miR-199a对膀胱癌抑制作用的研究

白羽1，臧学丽2，张四喜3，徐广宇4

(1.吉林医药学院 药学院，吉林 吉林 132013；2.长春医学高等专科学校 药学系，吉林 长春 130031；3.吉林大学第一医院 药剂科，吉林 长春 130021；4.北华大学 药学院，吉林 吉林 132013)

目的 研究miR-199a对膀胱癌的抑制作用。方法 按处理方法不同将T24膀胱癌细胞分为空白对照组(control group)、pre-scamble转染组(pre-scamble group)、pre-miR-199a转染组(pre-miR-199a group)。采用MTT法检测转染miR-199a对细胞增殖的影响，用流式细胞仪检测转染miR-199a后对细胞凋亡及细胞周期的影响，Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果 pre-miR-199a group OD 值(0.436±0.042)显著低于control group(0.634±0.020)和pre-scamble group(0.601±0.059)(P<0.05)。pre-miR-199a group细胞凋亡率为(19.25±1.57)%，显著高于control group(10.19±0.98)%和pre-scamble group(12.27±1.38)%(P<0.05)。Control group、pre-scamble group和pre-miR-199a group的G1期细胞百分比分别为45.09%、47.57%、58.62%，转染pre-miR-199a使细胞停滞在G1期。pre-miR-199a group细胞透过滤膜的平均个数为(46.00±1.58)个，显著低于control group(67.00±1.58)个、pre-scamble group(61.20±1.30)个(P<0.05)。结论 miR-199a能抑制膀胱癌细胞的生长。

miR-199a；膀胱癌；增殖；凋亡；细胞周期；侵袭

膀胱癌是临床上常见的肿瘤，据统计其发病率在世界范围内的恶性肿瘤中占第7位。在中国，膀胱癌是泌尿生殖系统发病率最高的肿瘤[1-2]。因此膀胱癌的治疗任重而道远。随着基因治疗的不断深入，miRNAs在肿瘤的早期诊断、预后判断与治疗开辟了新的道路[3]。最近的研究表明miR-199a参与多种细胞肿瘤的形成与发展。Murakami[4]发现肝癌细胞中miR-199a的表达明显降低。Yu T[5]研究发现miR-199a在口腔癌的发展过程密切相关，并作为病情判断的指标。但目前很少有对miR-199a对膀胱癌抑制作用的报道，本实验旨在揭示miR-119a与膀胱癌形成的关系，为膀胱癌的治疗提供新的帮助。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞株：T24膀胱癌细胞株购自中科院上海细胞库

主要试剂：胎牛血清、DMEM高糖培养基、青链霉素、PBS磷酸缓冲液，购自Hyclone；LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂、Trizol试剂，购自Invitrogen；Opti-MEM培养基，购自Gibco；Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒，购自Keygen；细胞周期检测试剂盒，购自凯基生物公司；Transwell细胞培养板，购自BD公司。

仪器：细胞培养箱、Multiskan Spectum Microplate 酶标仪，购自Thermo scientific；BDFACSCantoII流式细胞仪，购自BD公司；超净工作台，购自苏州安泰公司；U-CTR30-2倒置光学显微镜，OLYMPUSCKX41。

引物miR-199a，miR-199a-RT 5’-CTCAACTGTCGTGGAGT-CGGCAATTCAGTTGAGGAACAGGT-3’;miR-199a-F 5’-ACACTC-CAGCTGGGCCCAGTGTTCAGACTAC-3’;miR-199a-R 5’-TGGTG-TCGTGGAGTCG-3’上海英俊生物公司提供；miRNA模拟物，Pre-miR negative control。

1.2 方法 按照司彤[6]的方法并稍作修改进行细胞复苏、细胞培养。

1.2.1 MTT实验：将处于对数生长期的细胞消化成单细胞悬液，接种于96孔板，5×103细胞/孔，每组3个复孔，让细胞进行传代，当细胞汇合度达到50%～60%时使用pre-miR-199a(由miR-199a引物转染)、pre-scramble(由不含miR-199a的miRNA模拟引物转染)进行转染。转染时每孔加入200pmol RNA oilgo、5 μL Lipofectamine 2000、500 μL无血清培养液，混匀后室温孵育20 min，6h后更换为10%小牛血清培养基。按处理方法不同分为空白对照组(control group)、pre-miR-199a转染组(pre-miR-199a group)、pre-scamble转染组(pre-scamble group)。弃去培养液，用PBS洗涤细胞3次，每孔加入无血清培养液，加入转染混合物，37 ℃，5%CO2培养，6 h后换成10%血清的培养液。培养72 h后弃去培养液，每孔加入100 μL 1:10稀释的MTT底物溶液，于37 ℃反应2 h后使用酶联仪测OD450 nm处的吸光度，计算细胞增殖的抑制率。

1.2.2 流式细胞仪测细胞凋亡：将细胞培养板中的细胞用2 mL PBS洗涤，之后弃去PBS溶液，将细胞置于冰上，加入0.25%的胰蛋白酶0.5 mL，孵育，并轻轻吹打使细胞从培养板壁上脱落。将细胞预冷与1×结合缓冲液中使其密度约为1×106细胞/mL。取0.5 mL细胞悬液到离心管中，加入1.25 μL Annexin V-FITC，室温下避光反应15 min，之后常温1000 r/min，离心5 min，弃去上清，再次用0.5 mL预冷的1×结合缓冲液重悬，加入10 μL Propidium Iodide，用流式细胞仪进行检测分析。

1.2.3 流式细胞仪测细胞周期：按上述方法进行转染48 h后，将细胞用胰蛋白酶消化成单细胞悬液，4 ℃，1000 r/min，离心5 min，PBS充分悬浮细胞，上述条件再次离心2次，加入-20 ℃预冷的75%乙醇1 mL，混匀后4 ℃固定24 h。离心收集细胞，用1 mL PBS洗涤细胞，加入500 μL PBS含50 μg/mL溴化丙啶，100 μg/mL RNaseA，0.2%Triton-X-100,4 ℃避光孵育30 min，之后用流式细胞仪分析。

1.2.4 Transwell侵袭实验：调整处于对数生长期的B、C组细胞，使细胞密度为1×105细胞/mL，将100 μL细胞悬液加入Transwell小室，将600 μL完全培养液加入对应的底部24孔板各孔中，于37 ℃，5%CO2培养16 h，之后用棉签擦除Transwell小室内部的细胞，乙醇固定细胞10 min，用结晶紫染液染色。显微镜下观察处于微孔滤膜侧面上的侵袭的肿瘤细胞，400倍显微镜(OLYMPUSCKX41)下计数随机5个不同视野的侵袭细胞数，取平均值，细胞数目反映了细胞侵袭能力的高低。

2 结果

2.1 MTT实验 结果发现，转染pre-miR-199a后的OD值显著低于control group和pre-scamble group(P<0.05)见表1。

表1 MTT法观察各组T24膀胱癌细胞的增殖(n=3)Tab.1 Proliferation of T24 bladder cancer cell in each group determined by MTT method(n=3)

*P<0.05，与对照组相比，compared with control group；#P<0.05，与pre-scramble group比较，#P<0.05，compared with pre-scramble group

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡 经pre-miR-199a转染后T24膀胱癌细胞的凋亡率为(19.25±1.57)%，与control group (10.19±0.98)%和pre-scamble group (12.27±1.38)%相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 流式细胞仪对细胞凋亡的检测(n=3)*P<0.05，与control group比较；#P<0.05，与pre-scramble group比较Fig.1 Cell apoptosis detected by flow cytometry(n=3)*P<0.05，compared with control group; #P<0.05，compared with pre-scramble group

2.3 流式细胞仪检测细胞周期 Control group、pre-scamble group和pre-miR-199a group的G1期细胞百分比分别为45.09%、47.57%、58.62%，可见转染pre-miR-199a使细胞停滞在G1期。见图2。

图2 流式细胞仪对细胞周期的检测Fig.2 Cell cycle detected by flow cytometry

组别细胞周期(%)G1SG2空白对照组45.0934.5820.33pre-scamble转染组47.5733.3219.11pre-miR-199a转染组58.6224.1817.20

2.4 Transwell侵袭实验 Transwell侵袭实验是通过计数细胞透过滤膜的个数来衡量细胞侵袭能力的，见图3。3组细胞透过滤膜的平均个数分别为(67.00±1.58)、(61.20±1.30)、(46.00±1.58)个。可见pre-miR-199a group与其余2组相比具有明显的差异性(P<0.05)。说明T24膀胱癌细胞在转染pre-miR-199a后细胞侵袭能力下降。

图3 Transwell实验结果(×400,n=5)*P<0.05，与control group比较；#P<0.05，与pre-scramble group比较Fig.3 Result of transwell experiment (×400,n=5)*P<0.05，compared with control group; #P<0.05，compared with pre-scramble group

3 讨论

miRNA属于小RNA家族，通常长度为18～24个核苷酸。其大部分位于编码蛋白或非编码蛋白mRNA转录物的内含子中[7-8]。目前对miRNAs的了解甚少，目前的研究发现miRNA参与细胞的增殖、凋亡、分化、代谢以及个体发育和病毒感染等过程[9]。尤其是miRNA对肿瘤细胞增殖的影响成为目前研究的热点。Porkka KP等[10]发现miR-199a在前列腺癌中的表达下调。Lee JW等[11]的研究发现miR-199a在宫颈癌中的表达上调。可见miR-199a在个肿瘤细胞中的作用不尽相同。本研究中通过MTT实验及流式细胞仪检测细胞凋亡发现转染miR-199a后膀胱癌细胞的增殖明显受到了影响。一般细胞的分裂要经历G0/G1、S以及G2/M期，代表DNA合成前期、DNA的合成期和DNA的合成后期。本实验的流式细胞检测结果显示转染miR-199a能使膀胱癌细胞停滞在G1期，通过影响DNA的合成进而干扰膀胱癌细胞的有丝分裂。肿瘤细胞的侵袭是其生长的主要方式，肿瘤细胞可以呈巢或条索状沿组织间隙生长，破坏原有的组织结构，也可以如流水样沿组织间隙扩散，保留原有的组织结构。但无论怎样侵袭是恶性肿瘤的重要标志，常发生于肿瘤的晚期阶段，对治疗带来极大的挑战。本研究中转染miR-199a后可见膀胱癌对组织的浸润能力远较其他组下降。更进一步明确了其在对抗膀胱癌中的作用。miRNA抑制肿瘤的细胞的作用机制各异，miR-29a能抑制乳腺癌TTP蛋白的高表达[12]。MiR-15a和miR-16通过调节AKT3、RPS6、MAP激酶和NF-κB激活MAP3KIP3进而发挥其抗肿瘤活性[13]。关于miR-199a抑制膀胱癌的作用机制有待于进一步的研究明确。

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(编校：王俨俨)

Inhibitory effect of miR-199a on bladder cancer

BAI Yu1, ZANG Xue-li2, ZHANG Si-xi3, XU Guang-yu4

(1.College of Pharmacy, Jilin Medical University, Jilin 132013, China; 2.Department of Pharmacy,Changchun Medical College, Changchun 130031, China; 3.Department of Pharmacy, The First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, China; 4.College of Pharmacy, Beihua University, Jilin 132013,China)

ObjectiveTo study the inhibitory effect of miR-199a on bladder cancer.MethodsT24 bladder cancer cells were divided into control group, pre-scamble group and pre-miR-199a group according to different treatment.Cell proliferation was assayed by MTT, cell apoptosis and cell cycle by flow cytometry, and cell invasion by Transwell.ResultsThe OD value of pre-miR-199a group (0.436±0.042) was significantly lower than that of control group (0.634±0.020) and pre-scamble group (0.601±0.059)(P<0.05).Cell apoptosis of pre-miR-199a group(19.25±1.57)% was higher than that of control group(10.19±0.98)% and pre-scamble group(12.27±1.38)%(P<0.05).The cell ratio in G1 phase of control group、pre-scamble group and pre-miR-199a group was 45.09%, 47.57%, and 58.62%, respectively.The cell cycle arrested in G1 phase after transfected with pre-miR-199a.The cells migration number of pre-miR-199a group (46.00±1.58) was lower than those of control group(67.00±1.58) and pre-scamble group(61.20±1.30)(P<0.05).ConclusionMiR-199a could inhibit the growth of bladder cancer cells.

miR-199a; bladder cancer; proliferation； apoptosis; cell cycle; migration

卫计委吴阶平专项基金(320.6750.13216)；吉林省教育厅资助项目(吉教科合字[2014]第505 号)；北华大学博士启动基因项目(2014)

白羽，女，博士，讲师，研究方向：生物化学与分子生物学，E-mail：baiyu218@163.com；徐广宇，通讯作者，男，博士，讲师，研究方向：微生物与生化药学，E-mail：xuguangyu2005@163.com。

R737.14

A

1005-1678(2015)07-0032-03