四种石杉植物甲基转移酶基因的克隆与序列分析

张君诚，陈作毅，宋育红

(1.福建省资源环境监测与可持续经营利用重点实验室，福建 三明 365004; 2.复旦大学-三明学院 天然药物工程研究中心，福建 三明 365004)



四种石杉植物甲基转移酶基因的克隆与序列分析

张君诚1，2，陈作毅1，宋育红1，2

(1.福建省资源环境监测与可持续经营利用重点实验室，福建 三明 365004; 2.复旦大学-三明学院 天然药物工程研究中心，福建 三明 365004)

目的 克隆和分析长柄石杉(Huperziaserratavar.longipetiolata)、闽浙马尾杉(Phlegariurusminchegensis)、华南马尾杉(Phlegariurusaustrosinicus)和有柄马尾杉(Phlegariuruspetiolatus)4种石杉科植物的甲基转移酶基因编码区序列。方法 采用RT-PCR技术，以提取的石杉科植物总RNA为模板，扩增得到甲基转移酶基因编码区序列，采用BLAST和MEGA 5.0软件分析克隆的序列进行分析。结果 克隆的4种石杉科植物甲基转移酶基因序列与数据库中被注释为编码甲基转移酶的基因序列保持高度的相似性。结论 克隆得到了4种石杉科植物的甲基转移酶基因，为进一步阐明石杉碱甲生物合成与代谢途径奠定了基础。

甲基转移酶；石杉科；基因克隆；序列分析

石杉科植物属多年生小型的蕨类植物，普遍含有石杉碱甲(Huperzine A，HupA)[1]，石杉碱甲是一种低毒、高效、高选择性的中枢乙酰胆碱酯酶抑制剂，对治疗中老年痴呆具有显著疗效[2]。目前石杉碱甲几乎全部依赖于石杉科范围内的天然来源[3-5]。石杉碱甲开环的吡啶酮环和六氢吡啶环结构的复杂性，使其人工合成的成本远高于植物提取[6]，且目前已合成的一百多个石杉碱甲类似物的抑酶活性大多明显不如天然石杉碱甲[7]。近年来生物合成与代谢工程已成为提高植物次生代谢物产量的潜在途径之一。在石杉碱甲生物合成过程中，N-甲基转移酶编码的蛋白定位于石杉碱生物合成途径下游石杉碱与石杉碱甲之间甲基转换的催化酶，可以特异性识别底物并转移N原子位上的甲基，使得石杉碱甲最终形成[8]。该酶对石杉碱甲生物合成极为重要，但关于该酶基因的研究报道极少[9]，因此，本研究旨在对该酶基因进行克隆及功能分析，有助于阐明石杉碱生物合成代谢途径。

1 材料与方法

1.1 药材及菌株 长柄石杉(Huperziaserratavar.longipetiolata)、闽浙马尾杉(Phlegariurusminchegensis)、华南马尾杉(Phlegariurusaustrosinicus)、有柄马尾杉(Phlegariuruspetiolatus)采集于福建省尤溪县高山村的福建省石杉科植物种质资源圃。植物材料由复旦大学潘胜利教授鉴定。

大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)Top10 菌株由本实验室提供。

1.2 试剂 TRIzon RNA试剂盒、DNA凝胶回收纯化试剂盒、高纯度质粒中提试剂盒(购自康为世纪公司)；pGEM®-T Easy载体系统试剂盒、M-MLV、RNAsin、Taq DNA聚合酶(购自Promega公司)；dNTP和DNA Marker(购自天根生物公司)；Oligo-DT18、甲基转移酶基因扩增引物Met-F和Met-R由博尚生物技术有限公司合成。其他试剂均为分析纯国产试剂。

1.3 仪器 PTC-100多功能热循环仪(美国MJ Research)；GIS 2008型凝胶成像系统(上海天能公司)；UV-1240紫外可见分光光度计(日本岛津)；HPS-250生化培养箱(武汉爱斯佩科学仪器有限公司)； DYY型双移定时电泳仪(北京市六一仪器厂)。

1.4 方法

1.4.1 RNA的提取和cDNA的合成：取4种石杉科植物新鲜材料，使用TRIzon RNA试剂盒提取总RNA；用紫外分光光度计进行浓度及纯度的测定；1%的琼脂糖电泳检测RNA完整性。再利用M-MLV反转录酶，按照该试剂盒说明书提供的反应条件和步骤进行实验操作，将RNA反转录成第一链互补链DNA(cDNA)。

1.4.2 石杉科植物甲基转移酶基因的扩增及测序：PCR扩增引物根据EST数据库序列(GenBank: GO913407.1)结合使用primer premier 5.0，oligo 6.0以及NCBI primer blast软件设计，由博尚生物(BioSune)技术有限公司代理合成，引物Met-F：5′- GCTGCCATTCTTCTCCAA-3′，Met-R：5′-TTGACTCGCC-TAACCCTC-3′。以4种石杉科植物的cDNA为模板，按照以下体系对LDC基因进行扩增：cDNA 2.5 μL，10×Buffer 5.0 μL，10 μmol/L上下游引物各1.25 μL，dNTP mix(10 mM each) 1.5 μL，25 mM MgCl24.5 μL，5 U/μL Taq酶 0.75 μL，终体积为30.0 μL。 反应程序：95 ℃预变性3 min；然后进行32个循环：95 ℃变性30 s，49.0 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s；循环结束后72 ℃延伸反应5 min，4 ℃条件下保存。1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对扩增所得目的片段进行切胶回收。

将回收产物与pGEM®-T Easy载体连接，使用新制备的Top 10感受态细胞进行转化，在含有氨苄的LB平板上进行培养，挑取单克隆菌落PCR扩增和电泳检测后选择阳性克隆送公司测序。

1.4.3 甲基转移酶基因序列分析：氨基酸序列比对美国国立生物技术信息中心(NCBI)的蛋白质序列数据库中的序列，再通过 MEGA 5 构建 Neighbor-joining 系统进化树。

2 结果

2.1 石杉科植物甲基转移酶基因克隆 克隆质粒中甲基转移酶基因片段的扩增结果见图1，结果显示甲基转移酶基因均被接入，条带约510 bp左右。

图1 4种石杉科植物甲基转移酶基因片段的质粒PCR扩增电泳图M.Marker; 1.长柄石杉; 2.闽浙马尾杉; 3.华南马尾杉; 4.有柄马尾杉Fig.1 Gel electrophoresis of plasmid PCR amplification of methyltransferase gene in four species of HuperziaceaeM.Marker;1.Huperzia serrata uar.longip etiolata;2.Phlegariurus.minchegensis;3.Phlegariurus.austrosinicus;4.Phlegariurus.petiolatus

2.2 各材料甲基转移酶基因的nucleotide blast下的blastn比对 通过blastn比对，4条序列测序结果在Nucleotide collection(nr/nt)核酸非冗余数据库均未获得相似性高的序列比对。

2.3 各材料甲基转移酶基因序列的blastx比对及系统发生构建 通过在蛋白质数据库中比对核酸序列翻译的氨基酸序列，可知各实验材料甲基转移酶基因均被注释为甲基转移酶，进一步佐证了所获得的基因序列为预期的酶基因。

从NCBI的非冗余蛋白数据库(Nr) 中选取与4种石杉科植物LDC基因编码蛋白相似性高的11个物种共17条LDC蛋白序列，使用Mega 5.0软件构建Neighbor Joining Tree系统进化树，氨基酸序列使用Clustal W下gonnet打分矩阵比对后，使用Bootstrap Method重复1000次算法下使用Poisson model计算各物种间两两距离。构建的Neighbor Joining Tree树型图，见图2。

图2再次验证了克隆的4种石杉科植物材料基因序列编码的蛋白质为甲基转移酶。在系统发生树中，石杉科植物甲基转移酶与毛果杨(Populustrichocarpa)、毛白杨 (Populustomentosa)、蓖麻(Ricinuscommunis)、正葡萄(Vitisvinitera)的氧甲基转移酶相似性高，与蕨类植物江南卷柏(Selaginellamoellendorffii)的氧甲基转移酶也保持较高的相似性。

图2 各材料甲基转移酶基因编码氨基酸序列的Neighbor Joining系统发生构建▲代表4种石杉科植物甲基转移酶氨基酸序列；●代表EST引物设计序列GO 914756.1Fig.2 Phylogenetic analysis of the methyltransferase amino acid sequence▲represents sequence of methyltransferase gene in the four species of Huperziaceae; ●represents ESTprimer design sequence GO 914756.1

3 讨论

如前已述，N-甲基转移酶(基因)催化石杉碱中间物N原子上甲基的转移，催化石杉碱与石杉碱甲之间的互相转化和石杉碱甲构造形成，是石杉碱甲生物合成途径的重要酶(基因)。在细菌、真菌、植物、动物甚至是人类基因组上关于甲基转移酶基因的克隆与分析有广泛的研究[10-14]，但对石杉科植物的研究报道不多，本研究组已报道的研究实验结果认为该基因虽然对于石杉碱生物合成不可或缺，但应该不是关键的限速酶[9]。

本研究克隆得到的4条甲基转移酶序列通过blastn比对虽然在Nucleotide collection(nr/nt)核酸非冗余数据库均未获得相似性高的序列比对，但通过在蛋白质数据库比对核酸序列翻译的氨基酸序列，可知各实验材料甲基转移酶基因均被注释为甲基转移酶，佐证了所获得的基因序列为预期的酶基因。这可能与密码子的偏爱性有关。在不同的物种中，由于生物基因组中的碱基含量不同，使得不同的密码子翻译的氨基酸相同，在进化关系上，体现出蛋白质的保守型大于核苷酸序列[15]。Banks JA等[16]对石松目中的江南卷柏(Selaginellamoellendorffii)的全基因组进行测序，对其表达和调控做了相关分析，其中江南卷柏的氧甲基转移酶的氨基酸序列与石杉科植物甲基转移酶氨基酸序列保持较高的相似性，说明该氨基酸序列表达的蛋白可能与江南卷柏的氧甲基转移酶具有相似的生物学功能。进化分析显示(见图2)克隆获得的石杉科植物甲基转移酶与毛果杨(Populustrichocarpa)、毛白杨(Populustomentosa)等植物的甲基转移酶的有高相似性，进一步佐证了所克隆的基因是甲基转移酶基因。研究结果丰富了为数不多的石杉科植物石杉碱生物合成与代谢调控可能途径中涉及到的关键酶基因序列，为进一步实现石杉碱甲生物合成奠定了必要的分子基础。

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(编校：王冬梅)

Cloning and sequence analysis of methyltransferase gene in four species of Huperziaceae

ZHANG Jun-cheng1,2, CHEN Zuo-yi1, SONG Yu-hong1,2

(1.Fujian Provincial Key Laboratory of Monitoring Resource Environment and Sustainable Management Utilization, Sanming 365004, China; 2.Research Center of Natural Medicines Engineer, Fudan University & Sanming College, Sanming 365004, China)

ObjectiveTo clone and analyze the coding region of methyltransferase gene from four species of Huperziaceae, the species includedHuperziaserratavar.longipetiolata,Phlegariurusminchegensis,PhlegariurusaustrosinicusandPhlegariuruspetiolatus.MethodsThe methyltransferase coding region sequences were cloned by RT- PCR with the template of total RNA extracted from four Huperziaceae．Then the sequences were analyzed by means of BLAST and MEGA 5.0 software.ResultsThe coding region sequences of the four species of Huperziaceae were highly similar to the methyltransferase in the database.ConclusionThe methyltransferase genes of the four species of Huperziaceae were cloned in this study.The result will provide a foundation for further elucidate the mechanism of Huperzine A biosynthesis and metabolic pathways in Huperziaceae plants.

methyltransferase; Huperziaceae; gene cloning; sequence analysis

福建省自然科学基金面上项目(2012J01145)；三明学院生物学省级重点学科开放基金项目

张君诚, 男，博士，教授，研究方向：药用植物资源与生物技术研究，E-mail：5988603101@163.com。

R931

A

1005-1678(2015)07-0013-04