重组人BAFF的原核表达及纯化

张育琳，马冽，华子春

(南京大学 生命科学学院/江苏省产业技术研究院医药生物技术研究所/南京市医药生物技术创业创新中心，江苏 南京 210023)



重组人BAFF的原核表达及纯化

(南京大学 生命科学学院/江苏省产业技术研究院医药生物技术研究所/南京市医药生物技术创业创新中心，江苏 南京 210023)

目的 本研究对TNF家族B细胞激活因子(B cell activating factor to the TNF family, BAFF) 的胞外区134～285位氨基酸残基进行克隆，构建原核表达载体pET21a-sBAFF，并进行表达及纯化。方法 以K562细胞系的cDNA为模板，采用PCR扩增sBAFF基因，构建pET21a-sBAFF。在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达sBAFF，超声碎菌，提取包涵体，经Ni2+-IDA亲和层析纯化，复性，采用SDS-PAGE鉴定纯化产物。结果 通过优化确定了目的蛋白适宜的诱导温度和诱导时间。表达的sBAFF相对分子量约为18000，目的蛋白占菌体总蛋白的38.59%，且主要以包涵体的形式存在。经过蛋白复性后有38.14%的sBAFF聚合成了有活性的三聚体，代表错误折叠的二聚体含量极低。结论 建立了成功的复性工艺，目的蛋白经过复性后形成具有活性的三聚体，为进一步研究BAFF的生物学功能以及以BAFF为靶点的自身免疫疾病药物开发奠定了基础。

B细胞激活因子；cDNA克隆；原核表达；蛋白纯化

B细胞激活因子(B cell activating factor, BAFF; 又称TNFSF13B, THANK, CD257, BLyS 或 TALL1) 是1999年发现的肿瘤坏死因子家族中的一员，是与人体免疫有关的细胞因子[1-3]。BAFF由285个氨基酸组成，其中1～46位氨基酸为胞内区，47～73位氨基酸为疏水的跨膜区，74～285位氨基酸为胞外区。BAFF位于细胞内的N端缺少信号肽，C端在胞外，属于Ⅱ型跨膜蛋白[1- 2]。BAFF主要表达在先天免疫细胞如单核细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞及滤泡树突细胞等。目前已知BAFF可与3种受体相互作用，分别是B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen, BCMA)[4- 5]、 跨膜激活物与亲环素配体相互作用因子(transmembrane activator and CAML interactor, TACI)[6]及BAFF受体(BAFF receptor3, BAFF-R, 也叫 BR3)[7]。其中，BR3是BAFF的特异性受体，而TACI和BCMA同样也是TNF超家族的另一成员APRIL的受体。BR3是唯一可被可溶性sBAFF三聚体激活的受体。同许多TNF家族成员一样，sBAFF多以三聚体型式存在，与其受体相互作用，实现其生物学功能[8]。在中性或碱性条件下，20个三聚体型式的sBAFF可通过其“Flap区”相互结合，形成类似病毒颗粒的60聚体型式，并可在酸性条件下发生不可逆的分离[9-10]。BAFF的“Flap”环为其特有，其他TNF家族蛋白没有此结构。三聚体形式的配体与其受体结合并不一定会激活下游信号通路，尤其是对于TACI，只有60聚体形式的BAFF才能激活它介导的生物学效应[11]。

研究发现，BAFF的异常表达与自身免疫性疾病密切相关。BAFF表达量的高低影响到B细胞的存活信号通路及产生自身抗体的B细胞的选择性凋亡[12]。普遍认为BAFF过表达与系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)、干燥综合征(Sjögren’s syndrom, SS)等多种自身免疫性疾病的发生和发展有着密切关系[13-14]。因此BAFF及其受体有望成为治疗相关性疾病的新靶点。BAFF可溶性形式为其发挥功能的主要区域，故本研究旨在对BAFF胞外区可溶性片段134～285位氨基酸残基进行克隆，构建原核表达载体。通过IPTG诱导蛋白表达，经纯化及复性得到目的蛋白，为体外研究sBAFF的结构与功能关系以及进一步探讨其生物学功能奠定基础，并为以BAFF与其受体为靶点的药物设计提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种和质粒:质粒pET21a；大肠杆菌E.coli Top10，E.coli BL21(DE3)均由本实验室保存。

1.1.2 试剂及耗材:DNA限制性内切酶 NdeI、XhoI，T4 DNA连接酶、DNA Marker购自Takara公司; KOD DNA Polymerase购自东洋纺(上海)生物科技有限公司;DNA凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自申能博彩生物工程公司; 蛋白胨、酵母浸膏购自Sigma公司; IPTG购自Sunshine 公司; 丙烯酰胺和双甲叉丙烯酰胺、TEMED购Bio-Rad公司; Ni2+-NTA agarose购自Qiagen公司；透析袋购自南京晚晴公司(MW8-10 kDa)；相关引物由南京金斯瑞生物技术公司合成。

1.1.3 实验仪器:高速离心机(CR22E，日本HITACHI公司)，超声波细胞破碎仪(SCIENTZ-II D，宁波新芝生物科技股份有限公司)，恒流泵(BT-100，上海沪西分析仪器厂有限公司)，蛋白质紫外检测仪(HD-7，南京普阳科学仪器研究所)，蛋白凝胶电泳仪(美国Bio-Rad)。

1.2 实验方法

1.2.1 sBAFF基因的扩增:根据GenBank中编码人sBAFF的cDNA序列，设计一对特异性引物，扩增编码134～285位氨基酸序列，上游引物F为：5’-GGAATTCCATATGGTTCAGGGTCCAG-3’，下游引物R为：5’-CGGCTCGAGCAGCAGTTTCAATG-3’。其中F和R分别含有酶切位点Nde I和Xho I(下划线标出)，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以K562细胞的cDNA为模板，PCR扩增sBAFF基因，反应条件为：95 ℃预变性5 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，共30个循环；最后72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.2 重组表达载体pET21a-sBAFF的构建及鉴定:对PCR得到的片段及载体pET21a分别用限制性内切酶NdeI、XhoI进行双酶切，利用T4 DNA连接酶将sBAFF酶切产物连接到pET21a载体上，并将连接产物转化到DH5α感受态细胞中，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上过夜培养。挑取单克隆，进行菌落PCR和双酶切鉴定，鉴定为阳性者提取重组质粒，由南京金斯瑞生物技术公司测序。

1.2.3 目的蛋白的表达及条件优化:将测序正确的重组质粒pET21a-sBAFF转化进大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。将重组菌接种于含50 μg/mL氨苄霉素的3 mL LB培养基中，37 ℃，220 r/min培养活化过夜。次日按1:100接种于50 μg/mL氨苄霉素的3 mL LB培养基中，37 ℃、220 r/min培养至菌体OD600约为0.6，加入IPTG至终浓度1 mM，分别在37 ℃下诱导表达5 h和20 ℃下诱导表达16 h。诱导结束后取菌液3 mL，离心去除培养基，PBS洗涤2次后用适量PBS重悬。菌液经超声破碎后(超声功率400 W，超声2 s，间歇2 s，总时间1 min)，12000 r/min 离心5 min，分离上清液和沉淀，沉淀用等量PBS重悬。分别取菌液、上清液、沉淀制样，进行SDS-PAGE凝胶电泳，分析目标蛋白的表达量和可溶性情况。

1.2.4 Ni2+-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白:确定了目的蛋白适宜的诱导温度和诱导时间后，分别将含有重组质粒pET21a-sBAFF的表达菌在500 mL LB培养基中扩增培养并诱导表达。离心收集菌体，PBS洗涤2次后用40 mL PBS重悬，冰浴超声破碎直至菌液呈半透明，于4 ℃，12000 r/min离心15 min，收集包涵体沉淀。向沉淀包涵体加入4 mL含有8 mol/L尿素和10 mmol/L PMSF的PBS，于冰上搅拌溶解，4 ℃，12000 r/min离心15 min，留取上清。首先将Ni2+-NTA亲和层析柱用Binding Buffer(含有8 mol/L 尿素的PBS)平衡。以0.2 mL/min的流速缓慢上样，使蛋白能够与柱子充分结合。用Binding Buffer平衡柱子5个柱体积后，用Washing Buffer(含有8 mol/L 尿素，50 mmol/L咪唑的PBS)洗脱杂蛋白。用含有不同浓度咪唑的Elution Buffer(含有8 mol/L尿素，200/500 mmol/L 咪唑的PBS)洗脱目的蛋白。收集各组分的洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳，分析目的蛋白的洗脱情况。

1.2.5 蛋白的透析复性:将透析袋于含2%NaHCO3和1 mmol/EDTA的溶液中煮10 min，用ddH2O冲洗干净，再于1 mmol/L EDTA的溶液中煮10 min，用ddH2O冲洗干净。将含有纯度较高的目的蛋白的洗脱缓冲液装入预处理的透析袋中。复性缓冲液由含不同浓度的尿素(6、4、2、1、0 mol/L)和0.1 mmol/L PMSF的PBS组成。目的蛋白在4 ℃经上述尿素浓度不断降低的复性缓冲液中搅拌透析，每次8 h，使变性的目的蛋白在此过程中自然复性，从而得到有活性的目的蛋白。透析结束后，经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定其复性效果。

2 结果

2.1 sBAFF基因扩增产物的鉴定 以K562细胞的cDNA为模板，设计含有特定酶切位点的特异性引物，对BAFF的134～285位氨基酸进行扩增，预期扩增产物sBAFF大小分别约为468 bp。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳后，可见条带清晰单一，片段大小与预期结果一致，结果见图1。

图1 sBAFF扩增的PCR产物M：DNA marker；1：sBAFFFig.1 Amplification of sBAFF by PCRM: DL2000 DNA Marker; 1: sBAFF

2.2 重组表达质粒的鉴定 经抗生素筛选和菌落PCR鉴定得到阳性重组子pET21a-sBAFF。质粒载体中含有T7启动子序列，采用T7引物进行测序。测序结果采用BLAST程序进行比对分析，确定与预期相符，成功将“Flap”区进行了有效突变。

2.3 目的蛋白的表达及条件优化 将构建成功的重组原核表达质粒pET21a-sBAFF转化大肠杆菌BL21(DE3)后，在1 mmol/L IPTG浓度下，分别在37 ℃下诱导表达5 h和20 ℃下诱导表达16 h。经SDS-PAGE分析表明，目的蛋白在2种不同诱导条件下都得到了有效表达，相对分子量约为18000，在菌体内主要以包涵体形式存在，见图2和图3。进一步灰度扫描显示，在37 ℃诱导5 h下，目的蛋白sBAFF的表达量占菌体总蛋白的32.16%，其中可溶的sBAFF占菌体上清总蛋白的19.02%。而低温20 ℃诱导16 h下，目的蛋白的表达量有所提高，sBAFF的表达量占菌体总蛋白的38.59%，其中可溶的sBAFF占菌体上清总蛋白的30.89%。说明20 ℃低温诱导不仅有利于增加目的蛋白的可溶性表达，而且有利于增加目的蛋白的总表达量。

图2 SDS-PAGE分析目的蛋白在37 ℃下的表达M：蛋白Marker；1：菌体总蛋白；2：上清；3：沉淀Fig.2 SDS-PAGE analysis of the recombinant target protein expressed at 37 ℃M: Protein molecular weight marker; 1: Total protein; 2: Supernatant; 3: Sediment

图3 SDS-PAGE分析目的蛋白在20 ℃下的表达M：蛋白Marker；1：菌体总蛋白；2：上清；3：沉淀Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant target protein expressed at 20 ℃M:Protein molecular weight markers；1: Total cellular proteins;2:Supernatant;3:Pellets

2.4 目的蛋白的纯化 目的蛋白主要以包涵体的形式存在，分离包涵体沉淀后在变性条件进行蛋白纯化。包涵体溶解物经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化，得到纯度较高的目的蛋白。对不同咪唑浓度的洗脱收集液进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果显示sBAFF在200 mmol/L咪唑洗脱下蛋白纯度较高，达到86.48%，见图4。因而收集纯度较高的目的蛋白进行后续的复性。

图4 纯化蛋白的SDS-PAGE分析1：菌体总蛋白；2：杂蛋白洗脱液；3：200 mmol/L咪唑洗脱液；4：1 mol/L咪唑洗脱液；M：蛋白markerFig.4 SDS-PAGE analysis of purified proteins1: Total proteins; 2: Wash fraction; 3: Eluent of 200 mmol/L imidazole; 4: Eluent of 1 mol/L imidazole; M: Protein molecular weight markers

2.5 目的蛋白的复性 对收集的目的蛋白采取逐步降低尿素浓度的方法进行透析，除去蛋白溶液中的尿素，使变性的目的蛋白缓慢地进行自然复性。复性后的目的蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分析，结果显示除了18 kDa处的条带外，在54 kDa处可见第二条条带，从分子量大小估计应为三聚体。因此，复性后的目的蛋白单体形成了有活性的三聚体，见图5。而凝胶扫描图像的灰度分析显示，经过蛋白复性后有23.75%的sBAFF聚合成了三聚体。蛋白浓缩后，sBAFF的三聚体提高到了38.14%。最终，目的蛋白总产率为10.86 mg/L。

图5 蛋白复性的SDS-PAGE分析M：蛋白marker；1,2：浓缩后sBAFF；3,4：未浓缩sBAFFFig.5 SDS-PAGE analysis of protein complex M: Protein molecular weight marker; 1, 2: Concentrated refolded sBAFF; 3, 4: Non-concentrated refolded sBAFF

3 讨论

BAFF的异常表达与自身免疫性疾病密切相关，故已成为治疗自身免疫疾病的新药物靶点。目前， BAFF抑制剂主要是针对类风湿性关节炎、SLE和多发性硬化症三类疾病。随着研究的不断深入，对于BAFF形式多样性的理解也更加丰富。BAFF相关的抑制剂也从最早针对sBAFF的特异性抗体药物Belimumab，发展到其它各种抗体类药物和融合蛋白类药物，如atacicept (TACI-Ig融合蛋白)等，再到针对sBAFF和膜结合BAFF的blisibimod等。

在本研究中，构建了sBAFF胞外区的原核表达质粒pET21a-sBAFF，以期望在体外模拟BAFF及其多聚体形式。本文通过摸索不同诱导温度和表达时间，探究不同表达条件对目的蛋白表达的影响，确定合适的诱导条件，以提高目的蛋白的产量。在20 ℃下诱导表达16 h，sBAFF得以有效表达，其表达量显著提高，从37 ℃下表达占菌体总蛋白的32.16%，提高到20 ℃下的38.59%，表达量提高了约20%。由于BAFF单体分子量较小，且含有一对二硫键，因此目的蛋白主要以包涵体形式表达。但是与37 ℃表达相比，降低表达温度可提高可溶性蛋白的含量，从37 ℃下可溶性占菌体上清蛋白的19.02%，提高到20 ℃下的30.89%，可溶性蛋白的表达量提高了约62.41%。因此，首先对20 ℃下表达的可溶性目的蛋白进行纯化，利用融合蛋白带有His标签的特征，使用Ni2+-NTA亲和层析进行纯化。然而在纯化过程中，目的蛋白未能有效结合到Ni柱上，可能是由于目的蛋白上融合的His标签在蛋白折叠过程中被包裹在蛋白内部而未能暴露，从而导致不能有效与Ni结合。因此，通过对包涵体进行变性溶解，打开蛋白折叠的高级结构，暴露His标签，再使用Ni2+-NTA亲和层析进行纯化得到了纯度较高的目的蛋白，为后期研究蛋白活性提供了可能。在对变性蛋白复性透析过程中，采取了逐步降低尿素浓度的方法，使目的蛋白重新缓慢进行正确折叠恢复其生物学活性。而BAFF单体内有一对分子内二硫键存在，如果二硫键发生错配，则会产生二聚体及基于二聚体的多聚体形式。同时，有活性的BAFF是以三聚体的形式存在的，故在复性过程中，BAFF单体能否有效聚合成三聚体与其恢复生物学活性密切相关，而有无二聚体存在则能够反映复性过程中是否发生了错误折叠。复性后的sBAFF经过SDS-PAGE分析显示蛋白主要以单体和三聚体形式存在，有38.14%的sBAFF聚合成三聚体，而代表发生错误折叠的二聚体含量极低，约1.21%，这说明本实验的复性工艺是成功的。如何进一步优化复性工艺、获得更高比例有活性的三聚体尚需进一步努力，以取得更加理想的效果。

本研究中，sBAFF的成功构建和表达、以及复性工艺的建立，为进一步在体外研究BAFF的作用机制奠定了初步的基础。同时为以BAFF为靶点的自身免疫性疾病的新型药物开发创造了条件。

致谢

感谢常州市科技局(CZ20130011、CE20135013、CZ20120004、CM20122003)，武进区科技局(WF201207)资助。

[1] Mackay F, Silveira PA, Brink R. B cells and the BAFF/APRIL axis: fast-forward on autoimmunity and signaling[J]. Curr Opin Immunol, 2007， 19(3): 327-336.

[2] Xiao Y, Motomura S, Podack ER. APRIL (TNFSF13) regulates collagen-induced arthritis, IL-17 production and Th2 response[J]. Eur J Immunol, 2008， 38(12): 3450-3458.

[3] Nardelli B, Belvedere O, Roschke V, et al. Synthesis and release of B-lymphocyte stimulator from myeloid cells[J]. Blood, 2001， 97(1): 198-204.

[4] Boulé MW, Broughton C, Mackay F, et al. Toll-like receptor 9-dependent and independent dendritic cell activation by chromatin-immunoglobulin G complexes[J]. J Exp Med, 2004， 199(12): 1631-1640.

[5] Mackay F, Leung H. The role of the BAFF/APRIL system on T cell function[J]. Semin Immunol, 2006， 18(5): 284-289.

[6] Chu VT, Enghard P, Riemekasten G, et al. In vitro and in vivo activation induces BAFF and APRIL expression in B cells[J]. J Immunol, 2007， 179(9): 5947-5957.

[7] Kern C, Cornuel JF, Billard C, et al.Involvement of BAFF and APRIL in the resistance to apoptosis of B-CLL through an autocrine pathway[J]. Blood, 2004， 103(2): 679-688.

[8] Liu Y, Hong X, Kappler J, et al.Ligand-receptor binding revealed by the TNF family member TALL-1[J]. Nature, 2003， 423(6935): 49-56.

[9] Liu Y, Xu L, Opalka N, et al. Crystal structure of sTALL-1 reveals a virus-like assembly of TNF family ligands[J]. Cell, 2002， 108(3): 383-394.

[10] Kim HM, Yu KS, Lee ME, et al. Crystal structure of the BAFF-BAFF-R complex and its implications for receptor activation [J]. Nat Struct Biol, 2003， 10(5): 342-348.

[11] Mackay F, Schneider P. Cracking the BAFF code[J]. Nat Rev Immunol, 2009，9(7):491-502.

[12] Grumont RJ, Strasser A, Gerondakis S. B cell growth is controlled by phosphatidylinosotol 3-kinase-dependent Rel/NF-kappa B regulated induction of c-myc transcription[J]. Molecular Cell, 2002， 10(6): 1283-1294.

[13] Hondowicz BD, Alexander ST, Quinn WJ 3, et al.The role of BLyS/BLyS receptors in anti-chromatin B cell regulation[J]. Int Immunol, 2007， 19(4): 465-475.

[14] Rochas C, Hillion S, Saraux A. et al.Transmembrane BAFF from rheumatoid synoviocytes requires interleukin-6 to induce the expression of recombination-activating gene in B lymphocytes[J]. Arthritis Rheum, 2009， 60(5): 1261-1271.

(编校：谭玲)

Expression and Purification of recombinant soluble human BAFF

ZHANG Yu-lin, MA Cai-lie, HUA Zi-chunΔ

(School of Life Science, Nanjing University,Pharmaceutical Biotechnology Research Institute of Jiangsu Industrial Technology Research, Nanjing 210023, China)

ObjectiveTo construct pET21a-sBAFF by cloning the extracellular regions of 134-285 amino acids of BAFF, a member of human TNF family, and then express the gene in prokaryotic cells and purify the expressed product.MethodscDNA of K562 cell line was used as the template to amplify sBAFF gene to construct pET21a-sBAFF.Expression of sBAFF inE.coli BL21 was induced by IPTG, and the expressed proteins were assayed by SDS-PAGE.The bacteria were analyzed by sonication, and the target proteins mainly existed as inclusion bodies.Then sBAFF was purified by Ni2+-IDA affinity chromatography.SDS-PAGE electrophoreses displayed that the expressed sBAFF migrated with a relative molecular weight of 18000.ResultsThe induction parameters such as temperature and inducing time were optimized.The target protein accounted for 38.59% of the total bacterial proteins.After refolding, 38.14% of sBAFF proteins were polymerized as an active trimer.The dimer form of sBAFF, which is representative of wrongly refolded product, accounted for very few.ConclusionThe expression and purification of BAFF which formed active trimer after refolding pave the way for its further function study and provide a novel approach for the development of BAFF-targeted therapeutics for autoimmune diseases.

B cell activating factor; cDNA cloning; prokaryotic expression; protein purification

国家高技术研究发展计划(2012AA020304)、江苏省科技支撑计划-社会发展项目(BE2013630)

张育琳，女，硕士，研究方向：蛋白质纯化，E-mail:shirley9051@hotmail.com；华子春，通讯作者，男，博士，教授，研究方向：细胞生物学，E-mail：huazc@nju.edu.cn。

R392

A

1005-1678(2015)07-0001-04