四种中药材DNA提取方法的比较

张馨元，赵超越，侯和胜，佟少明

(辽宁师范大学 生命科学学院/辽宁省植物生物工程重点实验室，辽宁 大连 116081)



四种中药材DNA提取方法的比较

张馨元，赵超越，侯和胜Δ†，佟少明Δ†

(辽宁师范大学 生命科学学院/辽宁省植物生物工程重点实验室，辽宁 大连 116081)

目的 确定能够满足中药材DNA条形码研究的最适DNA提取方法。方法 以中药材甘草、黄柏、管花肉苁蓉和肉苁蓉为实验对象，采用改良高盐低pH法、改良SDS法、CTAB法、PVP法、PlantZol试剂盒及Ezup柱式试剂盒6种DNA提取方法进行DNA提取，采用紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳和ITS2与psbA-trnH序列的引物PCR扩增对DNA产量及质量进行检测。结果 改良高盐低pH法和Ezup柱式试剂盒提取的4种中药材的DNA质量相对较好，其OD260/OD280的值在1.7～1.9之间，PlantZol试剂盒法所提取的DNA得率相对较高，其次为改良高盐低pH法(P<0.05)，但PlantZol试剂盒所提取DNA的纯度较差，DNA电泳检测表明改良高盐低pH法、改良SDS法、CTAB法和PlantZol试剂盒所提取到甘草和管花肉苁蓉的DNA完整性较好，而6种方法所提取的黄柏与肉苁蓉的DNA则均在泳道内呈弥散状态，但只有改良高盐低pH法其ITS2和psbA-trnH序列的引物PCR扩增成功率为100%。结论 改良高盐低pH值法提取的基因组DNA可以用来中药DNA条形码的建立，且该方法具有成本低、步骤简单、时间短等优点，是一种高效、快速、经济的中药材基因组DNA提取方法。

DNA条形码；DNA提取；甘草；黄柏；管花肉苁蓉；肉苁蓉

我国是药用植物资源多样性最丰富的国家，野生中药材是中华民族的瑰宝。近年来随着对外合作交流研究领域日益扩大，药材市场上存在大量不同替代品混用，不同地区同名异物入药，紧俏药材使用其近缘植物入药的现象[1]。DNA条形码技术(DNA barcoding)是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统，它可以实现对物种进行快速的自动鉴定[2]，是近年来生物分类和鉴定的研究热点，在物种鉴定方面显示了广阔的应用前景[3-5]。2009 年，陈士林等[6-7]通过对6000余份药用植物样本进行DNA条形码序列筛选，表明ITS2序列的鉴定能力优于国际条形码协会植物工作组推荐的rbcL+matK组合，首次提出将ITS2序列作为药用植物鉴定的通用DNA条形码，并建立了以ITS2为核心，psbA-trnH为补充序列的药用植物条形码鉴定体系。DNA提取是开展中药材DNA条形码研究的首要环节，已有的中药DNA条形码研究中多从硅胶干燥的叶片或其他新鲜组织中提取DNA、扩增、测序后获得目标片段以区分物种[8-10]，但市售中药材大多为干品，而中药材的加工炮制和贮藏的整个过程，如日晒、高温烘干等都会使基因组DNA降解。本研究对6种DNA提取方法进行比较，筛选出适合中药材DNA条形码分析的通用DNA提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料 皮类中药材黄柏(P.ChinensisCortex)，中药材甘草(G.uralensisFisch)，茎类中药材肉苁蓉(C.deserticolaMa)，茎类中药材管花肉苁蓉(C.tubulosaWight)。

1.2 DNA提取 分别采用6种不同的DNA提取方法，对4种中药材进行了DNA提取。各实验重复3次。

1.2.1 改良高盐低pH法：本方法参照罗焜等[11]的方法，做适当改动。具体操作如下：取药材适量，去除表面污染，用刀片将其切成细小薄片于预冷研钵中，加液氮迅速研磨至粉末状，取0.1 g转入预冷的离心管中。加1 mL高盐低pH提取缓冲液[1.4%(w/v)SDS，100 mM KAc(pH 4.8)，50 mM EDTA (pH8.0)，0.5 M NaCl，2%(w/v)PVP， pH5.5]，65 ℃水浴40 min(其间颠倒混匀3～4次)；10000 r/min离心10 min，取上清液转入新管，加2/3体积的2.5 M KAc(pH4.8)，4 ℃冰箱放置15 min；取上清液转入新管，加等体积酚-氯仿-异戊醇(25︰24 ︰1)，颠倒混匀；10000 r/min离心15 min，取上清液转入新管，加0.7体积预冷异丙醇，4 ℃冰箱放置1 h；10000 r/min离心15 min，弃上清液，沉淀用70%乙醇清洗2次；10000 r/min离心5 min，弃乙醇，沉淀室温自然干燥后，加30 μL TE或dH2O定容，-20 ℃贮存备用。

1.2.2 改良SDS法：本方法参照陈莉等[12]的方法，做适当改动。具体操作如下：取药材适量，去除表面污染，用刀片将其切成细小薄片于预冷研钵中，加液氮迅速研磨至粉末状，取0.1 g转入预冷的离心管中，加入900 μL SDS提取缓冲液[100 mM Tris-HC1(pH 8.0)，50 mM EDTA，0.5 M NaC1，2%(w/v)PVP，用前加β-巯基乙醇至终浓度为2%]，混匀后加入350 μL 10%(w/v)SDS，65 ℃水浴10～15 min(其间颠倒混匀2～3次)；加入400 μL 5 mol/L KAc,混匀后冰浴30 min；10000 r/min离心15 min；取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇(24︰1)，充分混匀；8000 r/min离心10 min，重复离心1次；取上清，加入2/3体积预冷异丙醇，-20 ℃放置30 min。8000 r/min离心10 min；70%乙醇洗涤沉淀2次，沉淀室温自然干燥后，加30 μL TE或dH2O定容，-20 ℃贮存备用。

1.2.3 CTAB法：本方法参照段中岗等[13]的方法，做适当改动。具体操作如下：取药材适量，去除表面污染，用刀片切成细小薄片于预冷研钵中，加液氮迅速研磨至粉末状，取0.1 g转入预冷的离心管中，加800 μL 65 ℃预热的CTAB提取缓冲液[3%(w/v)CTAB,100 mM Tris-HC1(pH 8.0),20 mM EDTA,1.4 M NaC1,1%(w/v)PVP,用前加β-巯基乙醇至终浓度为0.2%]，65 ℃水浴40 min(其间颠倒混匀3～4次)；冷却至室温，加等体积酚-氯仿-异戊醇(25︰24︰1)，轻缓颠倒混匀；10000 r/min离心15 min，取上清液转入新管，加等体积酚-氯仿-异戊醇(25︰24︰1)，轻缓颠倒混匀；10000 r/min离心15 min，取上清液转入新管，加0.7体积预冷异丙醇，4 ℃冰箱放置1 h；10000 r/min离心15 min，弃上清液，沉淀用70%乙醇清洗2次；10000 r/min离心5 min，弃乙醇，沉淀室温自然干燥后，加30 μL TE或dH2O定容，-20 ℃贮存备用。

1.2.4 PVP法：本方法参照马文丽等[14]的方法，做适当改动。具体操作如下：取药材适量，去除表面污染，用刀片切成细小薄片于预冷研钵中，加液氮迅速研磨至粉末状，取0.1 g转入预冷的离心管中。加1 mL PVP提取缓冲液[200 mM Tris-HC1(pH 8.0)，25 mM EDTA，250 mM NaCl，50 g/L SDS，pH8.0]，65 ℃水浴30 min(其间颠倒混匀2～3次)；加入20 mg PVP粉末和0.5体积的乙酸铵溶液(7.5 M)，混合均匀，-20 ℃放置20 min；10000 r/min离心10 min，取上清液于新管，加0.6体积预冷异丙醇，-20 ℃放置沉淀20 min；12000 r/min离心2 min，弃上清液，沉淀用70%乙醇清洗2次；沉淀室温自然干燥后，加30 μL TE或dH2O定容，-20 ℃贮存备用。

1.2.5 PlantZol试剂盒法：PlantZol试剂盒购置于北京全式金生物技术有限公司，DNA提取操作过程完全参照说明书进行。

1.2.6 Ezup柱式试剂盒法：Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒(植物)购置于上海生工生物工程有限公司，DNA提取操作过程完全参照说明书进行。

1.3 DNA品质的检测

1.3.1 纯度和浓度检测：将所得DNA提取液稀释10倍后，用紫外/可见分光光度计，测定OD260及OD280的吸收值，以确定所提取DNA的纯度和浓度。

DNA浓度计算公式：DNA浓度(μg/μL)=OD260×0.05×稀释倍数

DNA得率计算公式：DNA得率(μg/g)=(DNA浓度×V原液)/m材料

1.3.2 电泳检测：取5 μL提取的DNA溶液上样进行电泳检测，电泳条件为1×TBE电泳缓冲液，0.7%琼脂糖凝胶，溴化乙锭染色后，凝胶成像系统观察并拍照。

1.3.3 PCR扩增检测：分别以提取的4种中药材的DNA为模板，采用通用引物ITS2和psbA-trnH进行PCR扩增[9,15]，引物序列为ITS2-F：5’-GCGATACTTGGTGTGAAT-3’，ITS2-R：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’；psbA-trnH-F：5’-GTTATGCAT-GAACGTAATGCTC-3’，psbA-trnH-R：5’-CGCGCATGGTGGAT-TCACAATCC-3’；反应体系为10 μL，其中：10×扩增缓冲液1 μL，dNTP混合物(各10 mmol/L)0.8 μL，上下游引物(10 mmol/L)各0.2 μL,模板DNA 1 μL，Taq DNA聚合酶(2 U/μL)0.1 μL，加双蒸水至10 μL。

2 结果

2.1 中药材甘草纯度、浓度和得率 对于中药材甘草，改良高盐低pH法、CTAB法和Ezup柱式试剂盒所提取到的DNA，其A260/A280均在1.7～1.9之间，表明得到的DNA质量较好，而PVP法与改良SDS法所提取到的DNA，其A260/A280小于1.7，表明得到的DNA中存在有蛋白质、多糖和酚类等物质的污染；PlantZol试剂盒提取到的DNA，其A260/A280大于1.9，说明得到的DNA中存在RNA的污染，见表1。

对于6种提取方法所提取的中药材甘草的DNA的得率进行方差分析，得到F值为175.659，P值为0.000。结果表明，PlantZol试剂盒与其他5种方法比较，得率显著高于其他5组(P<0.05)；改良高盐低pH法、改良SDS法和CTAB法，其得率间相比较，无统计学意义；这3种方法的得率显著高于PVP法和Ezup柱式试剂盒法(P<0.05)。综合考虑得率较高的4种方法，改良高盐低pH法与CTAB法为提取甘草总DNA的最佳方法。

表1 6种方法提取4种中药材总DNA的紫外吸收和得率±s)Tab.1 Ultraviolet absorption and yield of total DNA extracted from four kinds of Chinese traditional medical herbs by using six kinds of ±s)

*P<0.05，与改良高盐低pH法相比较，compared with modified high salt and low pH method;#P<0.05，与改良SDS法相比较，compared with modified SDS method；△P<0.05，与CTAB法相比较，compared with CTAB method；▽P<0.05，与PVP法相比较，compared with PVP method；▲P<0.05，与PlantZol试剂盒相比较，compraed with PlantZol kit

2.2 中药材黄柏纯度、浓度和得率 中药材黄柏，改良高盐低pH法和Ezup柱式试剂盒所提取到的DNA，其A260/A280均在1.7～1.9之间，表明得到的DNA质量较好，而其他4种方法所提取到的DNA，其A260/A280均小于1.7，表明得到的DNA中存在有蛋白质、多糖和酚类等物质的污染，见表1。

对于6种提取方法所提取的中药材黄柏的DNA的得率进行方差分析，得到F值为20.639，P值为0.000。结果表明，得率较高的改良高盐低pH法与PlantZol试剂盒2者之间无统计学意义；这2种方法分别与其他4种方法的得率相比较，差异有统计学意义(P<0.05)。但PlantZol试剂盒所提取黄柏DNA的纯度较差，其A260/A280为1.26，因此改良高盐低pH法为提取黄柏总DNA的最佳方法。

2.3 中药材管花肉苁蓉纯度、浓度和得率 中药材管花肉苁蓉，改良高盐低pH法、PlantZol试剂盒和Ezup柱式试剂盒所提取到的DNA，其A260/A280均在1.7～1.9之间，表明得到的DNA质量较好，而改良SDS法和PVP法所提取到的DNA，其A260/A280均小于1.6，表明得到的DNA中存在有蛋白质、多糖和酚类等物质的污染，CTAB法提取到的DNA，其A260/A280大于1.9，说明得到的DNA中存在RNA的污染，见表1。

对于6种提取方法所提取的中药材管花肉苁蓉的DNA的得率进行方差分析，得到F值为200.702，P值为0.000(P<0.05)。结果表明，改良高盐低pH法的得率显著高于其他5种方法的得率(P<0.05) ，因此改良高盐低pH法为提取管花肉苁蓉总DNA的最佳方法。

2.4 中药材肉苁蓉纯度、浓度和得率 对于中药材肉苁蓉，改良高盐低pH法和Ezup柱式试剂盒所提取到的DNA，其A260/A280均在1.7～1.9之间，表明得到的DNA质量较好，而改良SDS法、CTAB法和PVP法所提取到的DNA，其A260/A280均小于1.6，表明得到的DNA中存在有蛋白质、多糖和酚类等物质的污染，PlantZol试剂盒提取到的DNA，其A260/A280大于1.9，说明得到的DNA中存在RNA的污染。

对于6种提取方法所提取的中药材肉苁蓉的DNA的得率进行方差分析，得到F值为35.369，P值为0.000。结果表明， PlantZol试剂盒的得率显著高于其他5种方法(P<0.05)；改良高盐低pH法与CTAB法的得率相比较，无统计学意义；其得率与改良SDS法、PVP法和Ezup柱式试剂盒法两两比较，差异有统计学意义(P<0.05) ，但PlantZol试剂盒所提取到肉苁蓉DNA的纯度较差，因此改良高盐低pH法为提取肉苁蓉总DNA的最佳方法。见表1。

2.5 DNA电泳检测 观察6种提取方法所提取到的4种中药材DNA电泳图，发现4种中药材均存在不同程度的降解，其中改良高盐低pH法(见图1-A)、改良SDS法(见图1-B)、CTAB法(见图1-C)和PlantZol试剂盒(见图1-E)所提取到甘草和管花肉苁蓉的DNA可以观察到较为清晰的主带，其中图1-E所提取到甘草和管花肉苁蓉的DNA条带更加清晰，表明PlantZol试剂盒所提取的DNA完整性较好。而图1-A所提取到甘草和管花肉苁蓉的DNA拖尾现象较轻，说明高盐低PH法在提取过程中对杂质的去除效果较好。这6种方法所提取到的肉苁蓉的DNA在整条泳道中呈现弥散状态，其原因应是大量DNA已经降解成小片段DNA。而对于黄柏总DNA的提取，在泳道内几乎看不到弥散状的DNA，说明其DNA已严重降解。

图1 6种DNA提取方法所提取的4种中药材的DNA电泳图M.λ-Hind III digest DNA Marker；1.甘草；2.管花肉苁蓉；3.肉苁蓉；4.黄柏A.改良高盐低pH法；B.改良SDS法；C.CTAB法；D.PVP法；E.PlantZol试剂盒；F.Ezup柱式试剂盒Fig.1 Total DNA electrophoresis of four kinds of Chinese traditional medical herbs by using six DNA extraction methodsM.λ-Hind III digest DNA Marker; 1.Glycyrrhiza uralensis Fisch; 2.Cistanche tubulosa Wight; 3.Cistanche deserticola Ma； 4.Phellodendron Chinensis CortexA.improved high-salt combined low-pH method; B.improved SDS method; C.CTAB method; D.PVP method; E.PlantZol kit; F.Ezup kit

2.6 PCR扩增 使用候选条形码基因ITS2和psbA-trnH的通用引物对6种方法所提取到的DNA样品进行扩增，观察电泳图发现，通过改良高盐低pH法(见图2-A)所提取的DNA可以成功扩增出ITS2与psbA-trnH谱带，其中黄柏和肉苁蓉虽然在DNA电泳检测结果中条带模糊不清，但其PCR扩增结果依然清晰明亮，说明在中药材DNA提取过程中，DNA电泳检测结果不能直接影响PCR扩增结果。其他5种方法均未能100%扩增出谱带，其中中药材黄柏PCR扩增成功率最低，可能是提取的DNA中所含的杂质影响了Taq酶的活性。通过PVP法(见图2-D)所提取到的DNA只扩增出了管花肉苁蓉的ITS2与psbA-trnH的谱带，说明PVP法提取的DNA无法满足后续实验要求。

图2 6种DNA提取方法所提取4种中药材DNA的ITS2与psbA-trnH引物PCR扩增电泳图A.改良高盐低pH法；B.改良SDS法；C.CTAB法；D.PVP法 E.PlantZol试剂盒；F.Ezup柱式试剂盒M.DL2000 DNA Marker；ITS2；1甘草；2管花肉苁蓉；3肉苁蓉；4黄柏；psbA-trnH:5甘草；6管花肉苁蓉；7肉苁蓉；8黄柏Fig.2 Electrophoresis result of ITS2 and psbA-trnH primer PCR amplified with the total DNA extracted from four kinds of Chinese traditional medical herbs with six DNA extraction methodsA.improved high-salt low-pH method; B.improved SDS method; C.CTAB method; D.PVP method; E.PlantZo kit; F.Ezup kit；M:DL2000 DNA MarkerITS2:1 Glycyrrhiza uralensis Fisch; 2 Cistanche tubulosa Wight; 3 Cistanche deserticola Ma; 4 Phellodendron Chinensis Cortex；psbA-trnH:5 Glycyrrhiza uralensis Fisch; 6 Cistanche tubulosa Wight; 7 Cistanche deserticola Ma; 8 Phellodendron Chinensis Cortex

3 讨论

DNA条形码技术是近年来的一种新兴技术，该技术不受物种发育阶段和形态的限制，鉴定速度快，准确性高、获取信息量大，通用性强，使用方便。因此DNA barcoding技术将是今后生物物种鉴定发展的主要方向之一。中药DNA条形码鉴定工作流程包括：中药DNA提取、PCR 扩增与测序、条形码数据库的构建以及基于数据库比对鉴定物种，从中药材中获得高质量DNA是该流程的第一步也是进行后续条形码数据库建立的关键。本研究采用改良的高盐低pH值法从4种中药材中提取基因组DNA，并与改良SDS法和改良CTAB法等6种提取DNA的方法效果进行比较，结果表明在DNA提取过程中，PlantZol试剂盒所提取到甘草和管花肉苁蓉的DNA要比改良高盐低pH值法所提取到的DNA电泳条带更加清晰，但改良高盐低pH值法所提取的DNA其ITS2与psbA-trnH的PCR扩增成功率为100%要高于PlantZol试剂盒的PCR扩增成功率，可能是PlantZol试剂盒中试剂的成分对于像中药材这种富含多糖和多酚等次生代谢物质的去除不充分，致使对后续实验造成影响。

与新鲜组织不同，中药材的干燥过程缓慢，储存时间长，加工步骤繁多，使DNA降解严重，DNA含量降低。由于中药材中次生代谢产物含量高，尤其是中药材组织含有较多的多糖及酚类、酯类、萜类等次生代谢产物，会严重干扰DNA的提取。改良高盐低pH法的关键是采用低pH提取介质，能有效地防止组织破碎及沉淀时的电离化作用和酚类化合物的进一步氧化。本研究将0.1 g中药材与1 mL高盐低pH提取液混合，抽提比较充分，但是对于像黄柏这种极其富含多糖多酚的皮类中药材，与提取液混合后呈现出非常粘稠的胶质状态，因此可以增加提取液至2 mL使抽提更加充分。PVP可以有效去除中药材中富含的多糖，本实验研究证实PVP含量以2%为宜。低pH的醋酸钾溶液是有效的蛋白质沉淀剂,再加之酚-氯仿-异戊醇分层反复抽提使蛋白质的去除更加充分。

对提取的中药材DNA进行PCR凝胶电泳条带检测时，各种方法所提取的黄柏和肉苁蓉的DNA都看不到主带，大都在整条泳道中呈弥散状，有时甚至弥散的DNA泳带也看不见，其主要原因是本研究所用的中药材黄柏和肉苁蓉已经过“清水漂7天，取出滤干水分，切1分厚横片，晒干”等复杂的炮制过程，其DNA已严重降解。但在后续的PCR扩增时，只有改良高盐低pH法提取到的DNA样品可以100%得到PCR扩增产物，其他方法未能全部成功的获得PCR扩增产物，可能是提取的DNA中所含的杂质对Taq酶的活性影响较大，而无法扩增出条带。对于本文所研究的4种药材而言，改良高盐低pH法与其他方法相比具有DNA纯度和得率较高，能够满足后续试验要求等优点。对于本文未考察的叶、花、果以及动物材质等类型中药材，改良高盐低pH法是否优于其它方法有待进一步研究验证。

[1] 陈士林，苏钢强，邹健强，等.中国中药资源可持续发展体系构建[J].中国中药杂志，2005，39(15)：1141-1146.

[2] 肖金花，肖晖，黄戴维.生物分类学的新动向：DNA条形编码[N].动物学报，2004，50(5)：852-855.

[3] 陈士林，姚辉，宋经元，等.基于DNA barcoding(条形码)技术的中药材鉴定[J].世界科学技术，2007，9(3)：7-12.

[4] Li DZ,Liu JQ,Chen ZD,et al.Plant DNA barcoding in China[J].J Syst Evol,2011,49:165-168.

[5] Li M,Cao H,But PPH，et al.Identification of herbal medicinal materials using DNA barcodes[J].J Syst Evol,2011,49(3):271-283.

[6] CBOL Plant Working Group.A DNA barcode for land plants[J].Proc Natl Acad Sci USA， 2009,106(31):12794-12797.

[7] Chen SL,Yao H,Han JP,et al.Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J].PLoS ONE,2010,5(1):e8613.

[8] Yao H,Song JY,Ma XY,et al.Identification of Dendrobium species by a candidate DNA barcode sequence: the chloroplast psbA -trnH intergenic region[J].Planta Med,2009, 75(6):667-669.

[9] 罗焜，陈士林，陈科力，等.基于芸香科的植物通用DNA条形码研究[J].中国科学，2010，30(4)：342-351.

[10] 朱英杰，陈士林，宋经元，等.重楼属药用植物DNA条形码鉴定研究[J].药学学报，2010，45(3)：376-382.

[11] 罗焜，马培，姚辉，等.中药DNA条形码鉴定中的DNA提取方法研究[J].世界科学技术(中医药现代化)，2012，14(2)：1433-1439.

[12] 陈莉，魏莉，周童，等.几种中药DNA提取方法的比较研究[J].广西植物，2007，27(1)：137-139.

[13] 段中岗，黄琼林，杨锦芬，等.适合中药材DNA条形码分析的DNA提取方法的研究[J].中药新药与临床药理，2009，20(5)：480-484.

[14] 马文丽，石嵘.核酸提取与纯化实验指南[M].北京：化学工业出版社，2012：52.

[15] 宁淑萍，颜海飞，郝刚，等.植物DNA条形码研究进展[J].生物多样性，2008，16(5)：417-425.

(编校：王冬梅)

Comparison of DNA extraction methods from four Chinese traditional medical herbs

ZHANG Xin-yuan, ZHAO Chao-yue, HOU He-shengĆ, TONG Shao-mingĆ

(Key Laboratory of Plant Biological Engineering in Liaoning Province, College of Life Science, Liaoning Normal University, Dalian 116081, China)

ObjectiveTo establish an optimum DNA extraction method for Chinese traditional medical herbs in order to meet necessary for DNA barcoding research.MethodsFour Chinese traditional herbs,GlycyrrhizauralensisFisch,PhellodendronChinensisCortex,CistanchetubulosaWight andCistanchedeserticolaMa were chosen as the experimental materials, the DNA was extracted by 6 different kinds of DNA extraction method, including the improved method of high-salt combined low-pH,the improved method of SDS,CTAB method,PVP method,PlantZol Kit and Ezup Kit, the quality of DNA was investigated by ultraviolet spectrophotometry，agarose gel electrophoresis and PCR amplification by using specific primers of ITS2 andpsbA-trnH.ResultsThe quality of the DNA was better than other four kinds of methods by the improved method of high-salt combined low-pH and Ezup Kit, the value of OD260/OD280was between 1.7～1.9,the yield of DNA was the highest by the PlantZol kit , followed by the improved method of high-salt combined low-pH(P<0.05),but the purity of DNA was poor by the PlantZol kit.The DNA electrophoresis tests showed that the DNA integrity ofGlycyrrhizauralensisFisch andCistanchetubulosaWight were better with the improved method of high-salt combined low-pH, the improved SDS method, the CTAB method and the PlantZol kit.The DNA ofPhellodendronChinensisCortex andCistanchedeserticolaMa were extracted by the six methods appeared diffuse status in the lanes.But only the improved method of high-salt combined low-pH could make the PCR amplification of the success rate 100% by using specific primers of ITS2 and trnH-psbA.ConclusionThe DNA extraction method of high-salt combined low-pH can be used to establish the Chinese DNA barcoding which has the advantages of lower cost, simpler procedure and less time.

DNA barcoding; DNA extraction;GlycyrrhizauralensisFisch;PhellodendronChinensisCortex;Cistanchetubulosawight;CistanchedeserticolaMa

张馨元，女，硕士在读，研究方向：植物分子生物学，E-mail: 1172481464@qq.com；侯和胜，通讯作者，男，教授，博士生导师，研究方向：植物分子生物学，E-mail：hesheng_hou@126.com；佟少明，共同通讯作者，男，副教授，硕士生导师，研究方向：植物分子生物学，E-mail：tongsm@163.com。

Q523+.8

A

1005-1678(2015)07-0017-05