姜黄素治疗大鼠角膜碱烧伤的实验研究

李 妍，秦 莉，李晶明

（1.陕西省西安市第四医院眼科，陕西 西安 710004；2.西安交通大学第一附属医院眼科，陕西 西安 710061）

姜黄素治疗大鼠角膜碱烧伤的实验研究

李 妍1，2，秦 莉2，李晶明2

（1.陕西省西安市第四医院眼科，陕西 西安 710004；2.西安交通大学第一附属医院眼科，陕西 西安 710061）

目的 观察姜黄素对大鼠角膜碱烧伤新生血管（CNV）的抑制作用和对CD11b及角膜上皮凋亡细胞表达的影响，初步探讨其治疗角膜碱烧伤的作用机制。方法 选用雄性SD大鼠24只，随机分为4组（每组6只）：A组为空白组，B组为模型组，C组为姜黄素组，D组为二甲基亚砜（DMSO）组。除空白组外，采用氢氧化钠眼内烧伤造模，并予相应干预，第3、7、10、14天裂隙灯下观察角膜CNV形态并眼前节照相记录CNV长度，计算CNV面积，进行统计学分析；通过H-E染色法观察角膜病理形态学变化；免疫组化法观察CD11b表达；TUNEL染色法检测角膜上皮细胞凋亡表达。结果 裂隙灯下观察B组和D组CNV生长旺盛，管腔粗大，C组CNV稀疏管腔细小；3 d时三组CNV面积分析差异无统计学意义(P＞0.05)，7、10、14 d时CNV面积比较C组CNV面积显著降低(P＜0.05)；H-E染色B组和D组角膜基质层内大量的CNV管腔和血细胞，C组基质层偶见CNV，管腔细小；A组CD11b、角膜上皮凋亡细胞在角膜仅少量表达，B组和D组CD11b在基质层新生血管内壁上高表达，角膜上皮层凋亡细胞高表达，C组CD11b低表达，角膜上皮层凋亡细胞低表达。结论 姜黄素能有效的抑制大鼠角膜碱烧伤CNV治疗角膜碱烧伤，通过下调CD11b抗炎和下调角膜上皮凋亡细胞抗凋亡发挥作用。

姜黄素；角膜碱烧伤；新生血管；CD11b；角膜上皮层细胞；凋亡

角膜碱烧伤是眼外伤中一种严重的致盲性眼病。在我国，严重的角膜化学伤引起的角膜新生血管（CNV）占整个角膜疾病的10%。碱性化学物质发生皂化作用很快穿透眼组织，引起角膜新生血管、溃疡等导致视力丧失。目前治疗角膜碱烧伤的方法多种多样，但仍缺少一种有效、经济、安全的临床药物。姜黄素是我国的一种传统草药提取物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性[1]以及诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡[2]。安全性高毒性小，易溶于乙醇、二甲基亚砜（DMSO），微溶于水，近年来在眼科领域成为研究热点，研究表明姜黄素通过下调血管内皮生长因子(VEGF)的表达抑制新生血管[3]、通过抗增殖、抗纤维化诱导细胞凋亡治疗青光眼滤过瘢痕和翼状胬肉等[4]。2008年苏凡凡[5]研究姜黄素能抑制大鼠角膜碱烧伤CNV，但未探讨作用机制，同年胡静[6]探讨姜黄素治疗大鼠角膜碱烧伤是通过调控角膜超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）抗氧化作用机制实现的，近年来有关姜黄素治疗角膜碱烧伤的作用机制研究甚少，本实验在这些研究基础上进一步观察姜黄素抑制大鼠角膜碱烧伤的CVN，并通过检测姜黄素对炎性指标CD11b表达和角膜上皮细胞凋亡的影响，进一步探讨其作用机制。

1 材料

1.1 主要仪器和试剂

裂隙灯显微镜，眼前段照相系统（日本CANON公司），石蜡组织切片机（德国LEIKA公司）；兔抗大鼠CD11b多克隆抗体 （Abcom公司），SP免疫试剂盒和DAB显色试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司），TUNEL试剂盒（Roche公司），Whatman 3#滤纸（美国SIGMA公司），98.5%姜黄素原料药粉剂（50g/瓶，sigma公司），DMSO（上海榕柏生物技术有限公司），氢氧化钠、苏木素溶液和伊红溶液（西安生物化学试剂厂），TritonX-100和Tween-20(上海艾研生物科技有限公司)。

1.2 姜黄素的配制[7]

147 mg的姜黄素溶于10 mL的DMSO溶液中，浓度为40 mmol/L，按每管25 μL分装，避光保存于-20℃冰箱中，结膜下注射前以生理盐水按1∶1000稀释，现用现配。

1.30.1%DMSO试剂配制

0.1 mL的DMSO溶于100 mL的生理盐水中，4℃保存。

2 方法

2.1 造模与分组

清洁级健康无眼疾的成年雄性SD大鼠24只，购自西安交通大学动物中心，体质量（230±60）g，合格证号:0034325，许可证号:SCXK-(陕)2007-001，采用随机数字分组法分为4组 （每组6只）:A组为空白组，不给予任何处理；B组为模型组；C组为姜黄素组；D组为DMSO组，每组右眼为实验眼。B组、C组和D组动物分别用10%的水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，以直径3 mm的圆形滤纸片浸入1 mol/L NaOH溶液中20 s，置于干燥滤纸上吸除多余的碱液，均匀地贴于大鼠右眼角膜中央40 s，取下滤纸后生理盐水迅速冲洗1 min制造大鼠角膜碱烧伤模型[8]。

2.2 干预

B组结膜下注射生理盐水0.1 mL，C组结膜下注射浓度为40 μM姜黄素溶液0.1 mL，D组结膜下注射0.1%DMSO 0.1 mL，各组结膜下隔天注射1次，共注射7次。

2.3 观测指标

2.3.1 CNV面积计算 分别在第3、7、10、14天裂隙灯下观察大鼠角膜CNV形态改变，同时进行眼前段照相，记录CNV长度（以连续且弯曲度小，并与角膜缘切线垂直的新生血管长度为准）计算CNV面积。计算CNV面积公式[9]:

S为CNV生长面积，C为CNV网的跨圆周钟点数，r为角膜半径，l为新生血管长度。

2.3.2 CD11b表达及上皮细胞凋亡的检测 第14天颈椎脱臼处死所有实验大鼠，迅速摘取完整右眼球，显微角膜剪眼球后壁剪开约1 mm直径的小口，1 mL的注射器针头从小口刺入至角膜内皮层后，置15%中性甲醛溶液中固定48 h。眼球依次采用浓度梯度乙醇脱水，浸蜡包埋，采取矢状面切片，切片厚度4 μm。

（1）H-E染色观察角膜病理形态学改变:石蜡切片常规苏木精-伊红染色，二甲苯透明，中性树胶封片后光镜下观察角膜形态学变化。（2）免疫组化（S-P法）观检测CD11b:石蜡切片常规脱蜡完成水化，采用过氧化氢室温孵育，抗原修复，山羊血清封闭切片，滴加1∶10稀释的兔抗大鼠CD11b一抗过夜后，滴加生物素标记的二抗孵育，再滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素，用DBA显色试剂盒显色苏木精核复染，自来水冲洗返蓝，乙醇依次脱水，二甲苯透明后中性树胶封片，以PBS代替一抗作空白对照，观察CD11b表达。（3）TUNEL染色检测角膜上皮细胞凋亡:石蜡切片常规脱蜡完成水化，PBS洗涤3次，置于0.1%冰柠檬酸钠溶液冰上通透5 min，用PBS液冲洗2次，组化笔标记组织后加入20 μL的TUNEL混悬液，避光孵育1 h，冲洗封片。（4）数据平均光密度计算:每组各取6张切片，选取3个背景良好的视野区照相，CD11b染色结果采用Image ProPlus6彩色图像分析软件，分析每张图片中角膜组织区域的积分光密度（IOD）和面积（area），计算平均光密度值（IOD/area）。（5）凋亡率的计算:随机选取TUNEL染色角膜上皮细胞中3个高倍镜视野，计算角膜上皮凋亡细胞和和角膜上皮细胞总数，角膜上皮细胞凋亡率=角膜上皮凋亡细胞数/角膜上皮细胞总数×100%。

2.4 统计学分析

3 结果

3.1 CNV形态观察和CNV面积比较

如图1所示:裂隙灯下观察空白组，角膜透亮，无CNV；第3 d时各组均睫状充血，角膜碱烧伤区水肿明显，碱烧伤斑明显，角巩膜缘处新生血管芽呈刷状长出，三组CNV形态表现基本相同；7 d时模型组和DMSO组角膜新生血管生长旺盛致密，顶端分叉，接近碱烧伤区，碱烧伤区水肿明显；姜黄素组CNV顶端分叉稀疏，血管管腔细，未达到碱烧伤区，部分钟点位无新生血管，碱烧伤区水肿程度轻。10 d时模型组和DMSO组CNV致密呈网状，血管笔直，管腔粗大，范围广泛，顶端到达角膜中央交织，碱烧伤区灰白色水肿；黄素组CNV稀疏，开始退化，血管影可见，管腔细，碱烧伤区清亮。14 d时模型组和DMSO组CNV仍粗大致密，达到高峰开始消退；姜黄素组CNV大部分消退萎缩至碱烧伤区外，角膜大部分钟点位无CNV，血管管腔狭小，角膜上皮光滑。

如表1所示，角膜碱烧伤3 d时CNV面积比较组间差异无统计学意义（P＞0.05)。7 d、10 d和14 d时CNV面积比较组间差异有统计学意义（P＜0.05)。C组CNV面积显著降低，比较差异有统计学意义（P＜0.05)。

3.2 14 d各组病理形态学观察

如图2所示，14 d时A组H-E染色角膜5层结构清晰、完整，基质层无水肿增厚，见排列整齐的胶原纤维，未见新生血管腔；B组和D组角膜组织水肿增厚，基质层纤维排列紊乱，可见大量的CNV管腔、血细胞和炎性细胞，管腔粗大；C组角膜上皮趋于光滑平整，基质层水肿减退，厚度基本接近A组，基质层CNV消退减少，管腔狭小。

图1 角膜新生血管7、10、14 d形态观察

表1 大鼠角膜碱烧伤新生血管面积（±s，n=6，mm2）

表1 大鼠角膜碱烧伤新生血管面积（±s，n=6，mm2）

注:与模型组（B组）和DMSO组（D组）比较#P＜0.05；模型组（B组）和DMSO组（D组）比较P＞0.05。

组别B组C组D组F P 3 d 8.25±1.33 8.00±1.09 8.05±1.26 0.07 0.93 7 d 19.59±1.69 14.22±1.59#19.40±2.29 15.73＜0.05 10 d 23.14±1.77 15.54±3.39#22.27±2.34 8.86＜0.05 14 d 21.31±2.64 12.25±4.03#20.21±2.02 21.67＜0.05

图2 大鼠角膜碱烧伤光镜图（HE染色×100）

3.3 各组CD11b表达的比较

如图3所示，14 d时A组大鼠角膜上皮层和内皮层CD11b微量表达，B组和D组CD11b棕黄色颗粒增多，染色颗粒颜色增强，主要定位于角膜上皮层、基质层的新生血管内皮层，C组CD11b染色接近A组，棕黄色颗粒减少，染色颗粒颜色减弱，基质层CNV内壁染色颗粒减少。

图3 大鼠角膜碱烧伤基质层CD11b免疫组化显微图（×50）

CD11b表达比较，B组CD11表达显著高于A组（P＜0.05），C组CD11b表达显著低于B组和D组（P＜0.05），而D组与B组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

3.4 各组角膜上皮细胞凋亡的比较

14 d时A组见角膜上皮层下方细胞核黄棕色着染的凋亡细胞，B组角膜上皮层细胞核胞浆均黄棕色着染，出现大量的凋亡细胞，C组角膜上皮层下方可见凋亡细胞，上皮层细胞核仍蓝染，和A组相似，D组角膜上皮细胞核细胞浆均黄棕色着染，出现大量的凋亡细胞，和B组相似。见图4。

图4 大鼠角膜碱烧伤角膜上皮细胞凋亡显微图（TUNEL染色×50）

角膜上皮凋亡细胞表达比较，B组角膜上皮凋亡细胞表达显著高于A组 （P＜0.05），C组角膜上皮凋亡细胞表达显著低于B组（P＜0.05），而D组与B组比较，角膜上皮凋亡细胞差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠角膜CD11b平均光密度值和角膜上皮凋亡细胞凋亡率 （±s）

表2 各组大鼠角膜CD11b平均光密度值和角膜上皮凋亡细胞凋亡率 （±s）

注:与A组比较*P＜0.05；C组和B组、D组比较#P＜0.05，D组和B组比较P＞0.05。

组别A组B组C组D组 F P n 6 6 6 6平均光密度值（IOD/area）CD11b 0.007 6±0.000 6 0.031 9±0.002 5* 0.016 4±0.001 0#0.032 5±0.002 4 164.365 0＜0.05凋亡率（%）TUNEL 9.01±2.17 72.31±13.25* 12.34±3.10#75.72±11.14 58.40＜0.05

4 讨论

角膜过多的CNV破坏了角膜的微环境和透明性，成为临床上致盲的主要原因之一。CNV的形成机制复杂，VEGF学说是CNV目前公认的主要机制之一，戴鹏飞等[10]实验证明大鼠角膜碱烧伤后VEGF的表达和CNV的变化成正相关，林小俊[3]实验表明姜黄素能显著减少VEGF的表达抑制CNV。目前临床上尚缺乏理想的抑制CNV的药物，糖皮质激素能抗炎抑制CNV，但眼部使用副作用大，不能在眼表长期安全使用。美国上市的抗VEGF药物贝伐单抗（Avstain）能抑制CNV，但其价格昂贵，主要用于肿瘤内科，眼科使用受限。有研究表明姜黄素整体抗CNV的能力并不输于Avastin[11]。本实验中14 d时C组CNV比其它组在数量、长度和范围上减少，CNV面积减少，H-E染色观察C组角膜上皮光滑，基质层水肿轻，CNV数量少，证明姜黄素能有效地抑制大鼠角膜碱烧伤CNV。

角膜碱烧伤刺激大量的多形核白细胞（PMN）和炎性介质释放，发生急性炎症反应，中性粒细胞黏附因子CD11b在正常情况下低表达，但在炎症急性期大量表达，对白细胞等炎症细胞的迁移、聚集和趋化起着重要的作用，被认为是炎症反应的重要标志。正常的角膜组织中不同程度的存在着各种黏附分子，但均少量表达。整合素家族是黏附家族的重要成员之一，参与调控炎症期PMN的吸附、渗出和迁移[12-13]，CD11b/CD18是巨噬细胞分化抗原 1（Mac-1）——作为整合素家族中重要的膜蛋白，对PMN的调控作用显著，CD11b也就成为抑制机体炎症时加以阻断的重要靶点，使得多种因素可调控CD11b的表达[14]。近年有研究表明CD11b的高表达是重症肺炎患儿中性粒细胞的判断依据[15]、干预CD11b的表达可以减轻脓毒症大鼠的炎性反应等[16]。角膜碱烧伤早期PMN和淋巴细胞侵入病变区域，2周至3周时大量的PMN浸润，外界刺激改变了CD11b的构象，激活P53-MARK信号通路介导PMN等迅速到达感染部位发挥效应。本实验中A组CD11b仅微量表达，在碱烧伤炎症期CD11b在基质层和基质层新生血管内皮上高表达，证实了CD11b代表了炎症细胞，C组下调了CD11b的表达，为姜黄素通过抗炎作用机制治疗角膜碱烧伤奠定了理论依据。

细胞凋亡是生理性的，亦是病理性的。正常的角膜上皮细胞仅有少量的细胞凋亡维持生理代谢，角膜碱烧伤时炎症反应和细胞凋亡是同时存在的。角膜碱烧伤时眼表的炎症因子和促凋亡因子激活凋亡通路，同时产生大量的PMN和炎性细胞，过多的吞噬角膜坏死组织发生呼吸爆破，生成大量的活性氧簇 （ROS），ROS可以通过细胞氧化应激反应损伤细胞DNA，诱导细胞凋亡[17]。但也有研究表明姜黄素存在双向浓度调控，高浓度的姜黄素能显著增加细胞中的活性氧，激活线粒体凋亡途径，诱导细胞产生ROS，促进肿瘤细胞凋亡[18]。因此，姜黄素给药浓度的摸索是至关重要的。本实验中TUNEL染色角膜上皮细胞核染黄褐色颗粒的为阳性表达，B组角膜上皮细胞胞核和胞浆均黄褐色深染，C组姜黄素干预后角膜上皮层凋亡细胞减少，结果为姜黄素通过抗凋亡作用机制治疗角膜碱烧伤奠定实验基础。

姜黄素作为一种中药，具有多途径治疗疾病的特点，能有效地抑制角膜碱烧伤CNV，通过下调CD11b表达抗炎、抗角膜上皮细胞凋亡发挥治疗角膜碱烧伤作用，为临床治疗角膜碱烧伤提供新的理论依据，但其调控通路和作用机制仍不明确，需要从多途径、多层面的基础研究进一步探讨。

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（本文编辑 杨 瑛）

Study of Curcumin in Treating Corneal Alkaline Burn of Rats

Yan Li1,2,Li Qin2,Jing-Ming Li2
(1.Department of Ophthalmology,the Fourth Hospital of Xi'an City,Xi'an,Shanxi 710004,China;
2.Department of Ophthalmology,the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University,Xi'an,Shanxi 710061,China)

Objective To study the inhibition of curcumin on corneal neovascularization(CNV)in the corneal alkaline burned rats,and the effect on CD11b and corneal epithelium apoptosis.Then investigate its mechanism on treatment of corneal alkaline burn.Methods 24 male SD rats were randomly divided into 4 groups(6 rats in each group):Group A was the blank control group,Group B was the model group,Group C was the curcumin group,and Group D was the DMSO group.Except for the blank group,the other groups were modeled by sodium hydroxide to induce the burn in eyes and with the corresponding intervention.On the 3th day,7th day,10th day and 14th day,CNV was observed and taken photos with slit-lamp microscope.The CNV area was calculated accordingly,and all data were analyzed statistically.The pathological change was observed by H-E staining; the expression of CD11b in corneal was detected with immunohistochemical method;the corneal epithelial cell apoptosis was detected by TUNEL staining.Results The CNV of Group B and Group D was vigorous,its lumen was wider,CNV of Group C was scattered and small;The CNV area of three groups at 3th day was not statistically different (P＞0.05);The CNV area of Group C was decreased significantly at 7th, 10th,14th day (P＜0.05).After HE staining,there were amount of lumen of CNV and haemocytes in the stromal layer,CNV of group C was few and with small lumen.CD11b and TUNEL cells of Group A were lowly expressed in epithelium of cornea;CD11b of Group B and D in the CNV wall and corneal epithelium apoptosis were highly expressed,while that in Group C were with low expression.In B group,they were obviously expressed and had statistically significant conversely.Compared with B group,they were lower in C group.The expression level between D group and B group was no significant different.Conclusion Curcumin could inhibit CNV effectively in the corneal alkaline burned rats to antiinflammatory and anti-apoptosis effects through down regulating CD11b and corneal epithelium apoptosis.

curcumin;corneal alkaline burn;corneal neovascularization;CD11b;corneal epithelium;apoptosis

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.08.006

2015-01-30

陕西省科技攻关计划资助项目（2011k1402-04）。

李 妍，女，硕士，主治医生，研究方向:眼表疾病，白内障。