心痛泰颗粒对大鼠抗急性心肌缺血保护作用的实验研究

邓育兵，郭志华*，吴钟琴，宋汝汝

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

心痛泰颗粒对大鼠抗急性心肌缺血保护作用的实验研究

邓育兵，郭志华*，吴钟琴，宋汝汝

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007）

目的 探讨心痛泰颗粒对大鼠抗急性心肌缺血的保护作用的研究。方法 将大鼠随机分成6组，除假手术组10只外，余大鼠予以结扎大鼠冠状动脉左前降支造成大鼠急性心肌缺血损伤模型，成模大鼠随机分为模型组、心痛泰高、中、低剂量组及麝香保心丸组。分别给以蒸馏水、心痛泰低、中、高剂量及麝香保心丸进行灌胃2周后，观察3个时间点模型动物心电图ST段变化；采用ELISA法检测血清肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量；采用TTC染色测定心肌梗死面积；采用HE染色法观察心肌坏死组织病理变化。结果 与假手术组比较，模型组大鼠心电图S-T段抬高明显（P＜0.01）提示模型复制成功，模型组血清CK、LDH和MDA的浓度明显升高（P＜0.01），血清SOD浓度明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组有拮抗大鼠急性心肌缺血心电图S-T段抬高的作用（P＜0.05），且能明显降低血清CK、LDH活性和MDA浓度，升高血清SOD活性(P＜0.01)，明显缩小心肌梗死范围，保护心肌组织（P＜0.01）。结论 心痛泰颗粒抗急性心肌缺血心肌损伤的效果显著，对急性心肌缺血损伤大鼠有明显的保护作用。

心痛泰颗粒；急性心肌缺血；心肌酶谱；心肌梗死；丹参；川芎

心肌缺血是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢异常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态[1]。大量研究已表明中医药具有良好的抗心肌缺血的作用，在防治胸痹心痛方面有较为明显的优势，中医对心肌缺血的病机也有着深刻的认识，胸阳痹阻、气血不畅是其主要的病机[2-3]。以往临床表明心痛泰具有改善心肌缺血、保护心肌的功能，但其改善机制尚不清楚，本研究依据大鼠急性心肌缺血损伤模型动物实验，从相关指标，探讨心痛泰抗心肌缺血的药理效应，为心痛泰颗粒的临床推广应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与药品

1.1.1 动物 健康清洁级SD雄性大鼠100只，体质量250～300 g，由湖南中医药大学实验中心提供。动物许可证批号:SCXK(湘)2013-0004。

1.1.2 心痛泰的制备 中药饮片由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供。丹参、川芎、三七、山楂、郁金、枳壳、葛根等按照适当比例，加水提取2次。一煎加8倍量水提取1.5 h；二煎加6倍量水提取1 h；合并提取液，滤过，浓缩，真空干燥制成干浸膏，粉碎制粒，加适量糊精，制成颗粒剂，后60℃以下干燥整粒成品，4℃冰箱中保存备用。根据人与鼠的体表面积换算公式，配制成心痛泰丸低、中、高剂量组，分别灌服4.32、8.65、17.29 g/（kg·d），灌胃容积为10 mL/kg。麝香保心丸:上海和黄药业有限公司，规格:22.5 mg粒，批号:Z31020068。

1.2 主要实验仪器

切片机KD2258（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）；MOTIC显微图像摄影系统（麦克奥迪实业集团公司）；OLYMPUS BX43研究型正置显微镜（日本产）；RWD瑞沃德动物呼吸机 （深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；RM6280多导生理信号采集处理系统（成都仪器厂）；LEICA DM LB2型双目显微镜（德国LEICA公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 造模与分组 100只大鼠适应性饲养7 d后开始造模，造模按文献[4]报道的方法进行，以10%水合氯醛腹腔注射（3 mL/kg）麻醉，记录标准Ⅱ导联心电图，于第2～3气管环间行气管横行切开，插入气管插管。连接呼吸机进行人工控制呼吸，呼吸频率90次/min，潮气量10～12 mL，呼吸比设为1∶1。左前胸去毛，顺肋间隙方向于胸骨左旁第3～4肋间切开皮肤，于2～3肋骨间撑开进胸，切开心包，将心脏挤出，用1根零号医用缝合线结扎血管缝针，进针深度控制在0.1 cm，宽度为0.1～0.2 cm，假手术组仅穿线不结扎。关胸过程中放置排气管，关胸后，抽空胸腔积气后拔出。恢复大鼠自主呼吸，拨出气管内插管，气管切口及颈部切口开放，不作缝合。造模过程中持续观察心电图至结扎LAD 30 min后结束。观察S-T段抬高值:缺血0 min(观察是否造模成功)，15 min(观察各组S-T段抬高值的区别)，30 min(判断各组S-T段抬高值是否具有一定的差异，从而判定各给药组抗心肌缺血的效果)。造模过程中死亡大鼠36只，剩余64只大鼠，仅穿线不结扎的10只大鼠为假手术组（SHAM），剩余54只成模大鼠，按照随机数字表分为5组:模型组（I/R）、心痛泰高剂量组（HDG）、心痛泰中剂量组（MDG）、麝香保心丸组 （SBPG）各11只，心痛泰低剂量组（LDG）10只。

1.3.2 实验干预 I/R组和SHAM组灌胃等量蒸馏水，其他各组相应药物灌胃，各组每日灌胃1次，连续灌胃2周，灌胃容量均为10 mL/kg。灌胃过程中I/R组、MDG组、HDG组、SBPG组各死亡1只。

1.3.3 血液和组织标本采集与检测 在大鼠急性心肌缺血造模成功后，观察心电图30 min(即缺血30 min)完毕时，于腹主动脉取血，后取出心脏，用生理盐水清洗瘀血。血液于3 000 r/min离心10 min，取上清液(即血清)-20℃保存，采用ELISA法按照试剂盒操作说明书操作检测血清CK、LDH、MDA和SOD含量。

1.3.4 心肌坏死组织病理变化观察 将组织切片置于45℃水浴中展开，用黏附有多聚赖氨酸的载玻片捞片，37℃烘干后4℃保存，载玻片上刻写组别及粘片序号。Harris明矾苏木精染色液染色5～10 min。水洗，去除多余的染色液。1%盐酸酒精分化数秒。流水洗，直至组织切片充分蓝化。用酸化沉淀伊红染色液染色1～5 min。经70%、95%(2次)、100% (2次)酒精脱水各1～2 min，二甲笨透明1～2 min，共3次。中性树脂封片。Olympus BX43研究型正置显微镜在放大倍数10×40下观察心肌形态结构改变。

1.3.5 心肌梗死面积测定 采用断头法处死大鼠，迅速取出心脏，切除心房及右心室，放置于-20℃的冰箱中冰冻15 min，然后将左心室自心尖向心底平行于房室沟方向将左心室切成厚度相近的6片。然后置于2%氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸缓冲液(pH 7.4)中孵育20 min(37.0℃)，使存活心肌染成红色，而已坏死的心肌不染色。滤除TTC液，置于4%多聚甲醛溶液中固定保存。用数码相机拍照，用图像采集分析软件测量分别测量出心肌总面积、心肌梗死面积，心肌梗死面积（%）=心肌梗死面积/心肌总面积×100%。

1.4 统计学分析

数据采用统计软件SPSS 17.0进行统计分析。计量资料以“±s”表示，所有数据均进行正态性检验和方差齐性检验。两组样本之间的均数比较釆用t检验，多组样本之间的均数比较采用方差分析，方差齐时釆用LSD法、Dunnett法；当方差不齐时采用Tamhane’s T2法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠急性缺血过程中心电图S-T段的比较

与SHAM组比较，I/R组大鼠心电图S-T段抬高明显（P＜0.01），提示模型复制成功。各给药组与I/ R组比较，心肌缺血后各时间点，S-T段值均降低，差异有统计学意义（P＜0.05），表明心痛泰有拮抗心肌缺血时S-T段抬高的作用，对急性心肌缺血大鼠的心肌缺血损伤具有保护作用。见表1。

表1 各组大鼠急性缺血过程中心电图S-T段的比较（n=10，±s，mV）

表1 各组大鼠急性缺血过程中心电图S-T段的比较（n=10，±s，mV）

注:与SHAM组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与I/R组比较▼P＜0.05，▼▼P＜0.01。下表同。

缺血组别SHAM组I/R组LDG组MDG组HDG组SBPG组正常0.12±0.02 0.12±0.02 0.12±0.02 0.12±0.02 0.12±0.02 0.12±0.02 0 min 0.13±0.01 0.31±0.01** 0.25±0.02*▼0.23±0.01*▼0.21±0.01*▼0.18±0.01*▼15 min 0.14±0.02 0.41±0.03** 0.35±0.02*▼0.33±0.02*▼0.30±0.02*▼0.25±0.01*▼30 min 0.13±0.01 0.49±0.04** 0.41±0.03*▼0.38±0.04*▼0.34±0.03*▼0.32±0.02*▼

2.2 各组大鼠血清CK、LDH、SOD及MDA浓度的比较

用药 2周后，与 SHAM组比较，I/R组血清CK、LDH的活性和MDA浓度明显升高 (P＜0.01)，血清SOD活性明显降低(P＜0.01)；与I/R组比较各给药组均能明显降低大鼠血清CK、LDH活性和MDA浓度，升高SOD活性(P＜0.01)，见表2。

表2 各组对大鼠血清CK，LDH，SOD及MDA浓度 （n=10，±s）

表2 各组对大鼠血清CK，LDH，SOD及MDA浓度 （n=10，±s）

组别SHAM组I/R组LDG组MDG组HDG组SBPG组剂量(g/mL)——0.43 0.86 1.73 1.41 CK（ng/L）2 456.68±187.61 5 575.04±324.05** 5 162.56±170.98**▼▼4 462.09±95.22**▼▼3 760.76±112.80**▼▼2 947.75±192.86**▼▼LDH（ng/L）28.31±1.60 62.56±1.88** 56.65±1.60**▼▼50.09±1.71**▼▼40.92±2.33**▼▼34.83±1.80**▼▼SOD（U/L）240.57±9.67 108.04±4.74** 149.30±10.24**▼▼162.27±10.38**▼▼192.70±7.04**▼▼211.07±14.24**▼▼MDA浓度（nmol/L）3.10±0.27▼▼6.13±0.39** 5.19±0.16**▼▼4.57±0.14**▼▼4.17±0.16**▼▼3.68±0.35**▼▼

2.3 各组大鼠心肌缺血梗死面积的比较

灌胃2周后，SHAM组未见梗死区域，与I/R组相比，各用组的心肌梗死面积均有缩小，差异具有统计学意义（P＜0.01），与LDG组相比，MDG、HDG、SBPG组梗死面积有减小，差异具有统计学意义（P＜0.01），而MDG、HDG、SBPG组三者之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 用药2周后各组大鼠心肌梗死面积比较 （n=10，±s）

表3 用药2周后各组大鼠心肌梗死面积比较 （n=10，±s）

注:与I/R组比较▼▼P＜0.01；与LDG组比较**P＜0.01。

组别I/R组LDG组MDG组HDG组SBPG组心肌总面积（μm2）0.0123±0.0002 0.0101±0.0001▼▼0.0097±0.0001▼▼** 0.0089±0.0001▼▼** 0.0075±0.0001▼▼**心肌梗死面（μm2）0.0091±0.0001 0.0062±0.0001▼▼0.0048±0.0001▼▼** 0.0034±0.0001▼▼** 0.0023±0.0001▼▼**梗死面积比（%）73.98±3.38 61.37±0.45▼▼49.48±2.65▼▼** 38.20±3.44▼▼** 30.67±4.09▼▼**

2.4 心痛泰对急性缺血大鼠坏死心肌组织学的影响

用药2周后大鼠缺血心肌区心肌组织形态变化:SHAM组心肌细胞排列规则，少量细胞轻度水肿，细胞间质分布较均匀，有少量炎细胞浸润；I/R组心肌细胞排列紊乱，细胞水肿变性，间质增宽，较多炎细胞浸润，梗死区可见大量纤维化；LDG组心肌细胞排列与I/R组比较稍规整，较多心肌细胞水肿变性，间质增宽，较多炎细胞浸润，部分心肌梗死区可见纤维化；MDG组心肌细胞排列与I/R组相比规则，部分心肌细胞水肿变性，间质可见中等炎细胞浸润，心肌梗死区可见较少纤维化；HDG组心肌细胞排列较I/R组规则，细胞轻度水肿，变性程度明显减轻；间质少量炎细胞浸润，心肌梗死区可见少量纤维化改变；SBPG组心肌细胞排列较规整，部分细胞水肿，与I/R组相比，心肌细胞变性程度减轻，间质少量炎细胞浸润，梗死区可见少量纤维化改变。见图1。

3 讨论

心肌缺血是指当冠脉供血与心肌的需血之间失去平衡导致不能支持心脏正常工作的一种病理状态，可引起心绞痛、心肌梗死等严重疾病。心肌缺血时，冠脉血流量不能满足心肌代谢需要，引起心肌急剧的、暂时的缺血缺氧，心肌内聚集过多的酸性或多肽类代谢物质，从而刺激心脏自主神经引起心绞痛[5]。同时，在缺血过程中磷脂酶激活，产生具有膜活性的游离脂肪酸，破坏细胞膜，并释放大量儿茶酚胺，游离脂肪酸产生，以及白细胞释放的自由基均能导致细胞质膜损伤和通透性增加，而引起心肌酶的异常[6]。CK、LDH、MDA和SOD是临床上和实验研究公认的对心肌缺血有诊断意义的酶[7]，可作为判断心肌缺血损伤程度的指标。心肌缺血的最根本的防治措施仍然是改善血液供应，降低心脏耗氧，通过清除或对抗有害物质对心肌的不良影响以保护心肌。

图1 各组大鼠心肌组织形态图（HE，×400）

中医历代医家将心肌缺血归于 “胸痹”、“心痛”、“真心痛”等范畴[8]，其主要的病机为胸阳痹阻，气血不畅，导致心脉挛急或闭塞不通。历来中医药在心肌缺血的防治方面就具有重要的作用，大量的动物实验已经证实中药单体、方剂、中成药及针灸具有良好的抗心肌缺血作用，然而理气活血化瘀中药具有更为较好的抗心肌缺血的作用，不仅可以改善患者症状，还可以改善心肌血供，预防心肌病理损伤，可能对冠状动脉血管侧支形成或缺血再灌注有比较理想的药理效应[9]。心痛泰是由郭志华教授依据中医理论结合多年的临床实践经验，针对胸痹心痛气滞血瘀的病机，自制而成治疗冠心病的中药复方制剂，本方以丹参活血祛瘀止痛，合有“血中气药”之称的川芎共为君药，三七、郁金、木香、山楂共为臣，助君药调畅气机祛瘀止痛，佐以枳壳、葛根，一升一降共调气机。诸药配伍，使胸阳振，瘀血散，气机畅，共奏活血化瘀理气止痛之效。气行则血行，气血运行通畅，心之络脉就会得到充足的濡养，从而达到抗心肌缺血的作用。大量的前期临床实验显示该方可以通过调节血管内皮细胞产生的一氧化氮和内皮素平衡等有效防治急性心肌缺血损伤[10]，并且已在临床应用上得到了较好的反馈。

本实验以冠心病急性心肌缺血损伤大鼠模型作为研究对象，采用前瞻性动物实验的研究方法，运用活血化瘀、理气止痛中药复方制剂心痛泰进行干预，探讨其抗急性心肌缺血的药理效应。从各组心电图及相关指标表达情况可以看出心痛泰能够拮抗急性心肌缺血引起的心电图S-T段的抬高，降低CK、LDH、MDA浓度，升高SOD水平，改善受损的心肌组织，减小心肌梗死而积，有明显的抗急性心肌缺血的作用。从观察结果看出，各治疗组与I/R组相比，有明显的减小心肌梗死范围，改善受损心肌组织的程度，而且心痛泰颗粒与麝香保心丸组治疗效果相当。提示心痛泰颗粒具有对大鼠抗急性心肌缺血的保护作用。

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（本文编辑 匡静之）

Study of the Protective Effect of Xintongtai Granuel on Rats with Acute Myocardial Ischemia

Yu-Bing Deng,Zhi-Hua Guo*,Zhong-Qin Wu,Ru-Ru Song
(The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha，Hunan 410007，China)

Objective To investigate the protective effect of Xintaitong granule on the rats with acute myocardial ischemia.Methods The rats were randomly divided into six groups.Except for the10 rats in sham-operation group,the other rats were ligaturedleft anterior of coronary artery to establish the rat models of acute myocardial ischemia.The model rats were randomly divided into the model group,high-,medium-and low-dose of Xintongtai groups,and Shexiang Baoxin pill group, which were treatedseparately with distilled water,low-dose,medium-dose and high-dose of Xintongtai and Shexiang Baoxin pill by gavage for 2 weeks.Thechanges of ECG S-T segment at 3 time points of animal models were observed;Thecontentsof CK,LDH,MDA and SDA were detected by ELISA.The area of myocardial infarction was determined by TTC staining method; The pathological changes of myocardial necrosis tissue were observedby HE staining method.Results Compared with the shamoperation group,the S-T segment in model group rats was increased obviously(P＜0.01);The serum CK,LDH and MDA content increased significantly(P＜0.01),serum SOD content was significantly reduced(P＜0.01).Compared with the model group, the given medicine groups could against ECG S-T segment elevation of acute myocardial ischemiain rat(P＜0.05),they can significantly reduce the serum CK and LDH activity and MDA content,increase the serum SOD activity(P＜0.01),significantly reduced the size of myocardial infarct size,protect myocardial tissues (P＜0.01).Conclusion Xintongtai show obvious effect against acute myocardial ischemia myocardial injury and protective effect on rats with acute myocardial ischemia injury.

Xintongtai granule;acute myocardial ischemia;myocardial enzyme;myocardial infarction;Salvia miltiorrhiza; Szechuan Lovage

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.08.009

2015-05-04

邓育兵，男，在读硕士研究生，研究方向:中医内科心脑血管疾病。

*郭志华，男，教授，E-mail:guozhihua112＠163.com。