回神颗粒对双转基因阿尔茨海默病小鼠海马区Aβ1-42表达的影响

张玉岭，陈宝贵*

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津市武清区中医医院，天津 301700）

回神颗粒对双转基因阿尔茨海默病小鼠海马区Aβ1-42表达的影响

张玉岭1，陈宝贵2*

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津市武清区中医医院，天津 301700）

目的 探讨在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)病理早期采用回神颗粒对转基因AD小鼠的治疗作用。方法 采用聚合酶链式反应（PCR）法鉴定淀粉样前体蛋白/早老素1(APP/PS1)双转基因AD小鼠的基因表型后，选取3月龄雄性转基因阳性PAD小鼠和同龄、同背景的C57BL/6J野生型雌性小鼠作为实验对象。应用Morris水迷宫中逃避潜伏期、穿越平台的次数来评价小鼠的学习记忆能力，苏木精-伊红(HE)染色法观察小鼠脑组织形态学的改变，免疫组化法检测小鼠海马区β淀粉样蛋白(βamyloid protein，Aβ)1-42的表达水平。结果 回神颗粒治疗组小鼠学习记忆能力提高，与模型组比较，小鼠逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增多(P＜0.05)；穿越平台次数与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05);治疗组大脑海马区Aβ1-42表达阳性面积明显减少(P＜0.05)。与正常组相比，模型组AD小鼠大脑海马区Aβ1-42表达阳性面积明显增高(P＜0.05)。结论 回神颗粒可显著改善APP/PS1转基因AD小鼠的学习记忆能力，抑制Aβ1-42的过度表达、聚集。

阿尔茨海默病；APP/PS1双转基因小鼠；回神颗粒；β淀粉样蛋白1-42；人参；石菖蒲；鹿角胶

阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）俗称老年痴呆症，是一种进行性发展的神经系统退化性疾病，多发于老年期，病程缓慢不可逆，临床表现为记忆障碍、失语、失认、视空间技能损害、执行功能障碍、人格行为改变等全面性痴呆。数据表明，65岁以上人群患病率接近5%，85岁以上人群患病率已接近30%。老年痴呆患者从确诊开始，平均存活时间仅约7年[1-2]。由于缺乏理想的治疗手段和有效药物，AD一直为医学界比较棘手的疾病之一。中医根据辨证论治充分发挥中药复方多途径、多环节、多靶点、多向调节的作用特点，在防治AD方面具有西药无可比拟的前景和优势。

本研究利用国际公认的AD转基因动物模型APPswe/PS1dE9为研究对象，同时选用与APPswe/ PS1dE9同背景同月龄的C57BL/6J小鼠作为实验对照。在验证3月龄PPswe/PS1dE9双转基因小鼠存在典型的病理特征与学习记忆能力损害的基础上，观察回神颗粒对 APPswe/PS1dE9双转基因小鼠Morris水迷宫实验成绩及脑组织Aβ沉积的影响，以期验证回神颗粒对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠的保护性作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级（SPF）3月龄的APPswe/ PS1dE9双转基因小鼠20只；同背景同月龄野生型C57BL/6J小鼠20只(雄性)。许可证号:SCXK（京）2014-0004。实验动物及饲料皆购自北京华阜康生物科技股份有限公司，体质量（26.2±4.3）g。饲养于中国医学科学院生物医学工程研究所，小鼠分别饲养至6月龄进行动物行为学实验。

1.1.2 药物与试剂 回神颗粒（天律市武清区中医院院内制剂，5g/袋，批准文号:津药制字Z20070178号）；10%水合氯醛、磷酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液（CST）；琼脂糖凝胶和溴乙锭兔抗Aβ1-42、辣根过氧化物酶（HRP）二抗、浓缩型DAB试剂盒（博奥森生物有限公司）。

1.1.3 主要仪器 EthoVision XT型Morris水迷宫视频跟踪分析系统，荷兰Noldus公司；PCR扩增仪（Invitrogen,Grand Island,NY)由武清中医院检验科提供；脱水机、包埋机和切片机均有武清中医院病理科提供。

1.2 PCR法鉴定

PCR法鉴定APP/PS1转基因小鼠基因表型所生子代小鼠为阳性表达小鼠，具体方法如下[3]:（1）剪取小鼠鼠尾约0.5 cm放入1.5 mL离心管内；（2）每管中加入0.5 mL、裂解液，以12 000 r/min，56℃转动2 h以上，离心20 min，取上清液；（3）加入等体积异丙醇混匀，放置30 min；（4）12 000 r/min离心10 min，沉淀DNA。琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段。本实验所用的APPswe/PS1ΔE9双转基因小鼠表型稳定，PCR法鉴定小鼠基因型，PCR产物长度为:APP 300 bp左右，PS1 600bp左右 （marker为DL 2000 DNA Marker）。筛选阳性表达的20只小鼠用于本次实验。

1.3 动物分组与干预方法

PCR检测鉴定后的3月龄APP/PS1双转基因阳性的雄性小鼠，按随机数字表法随机分为模型组和治疗组，每组各10只；同龄、同背景的C57BL/6J阴性纯合子(野生型)雄性小鼠按随机数字表法随机分为正常组和正常加药组，每组各10只。治疗组和正常加药组，将回神颗粒用生理盐水稀释成混悬液灌胃，人的服用剂量为了15 g/d,换算成大鼠剂量为了15 g/d×0.018=0.27 g/d,配成1 mL灌胃液灌服，2次/d。阴性对照组灌服同等体积的生理盐水，持续3个月。

1.4 Morris水迷宫试验

实验前将水桶灌以清水至24 cm高度，水温控制在23～25℃之间。在池壁上以不同形状的标志物标记四个象限的入水点，实验数据录入表格时分别记录为东、南、西、北4个标记点，以这4个点将水面和水桶分成均等的4个象限。在其中一象限正中离池壁35 cm处放一个直径为9 cm的圆形平台，平台顶低于水面1 cm。迷宫上方的视频拍摄系统同步记录小鼠游泳轨迹。第一天实验前及最后一天实验结束后撤去平台，将小鼠放入水池中自由游泳60 s，检测各组小鼠间的游泳速度有无差异。整个测试持续6 d，前5天为隐蔽站台实验，第6天为空间探索实验。

1.5 组织取材与指标检测

各自小鼠于末次行为学测试后进行脑组织取材。采用快速断头取全脑，用滤纸吸干，称质量。小鼠脑组织放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h以上(4℃)，之后换后固定液，固定好后行石蜡包埋，进行病理及免疫组化染色。

1.5.1 HE染色 取大脑海马处组织标本，常规酒精梯度脱水，二甲苯媒浸，55～60℃浸腊，石蜡包埋，切片，常规苏木素-伊红染色，脱水透明、封片。

1.5.2 免疫组化检测 常规组织切片脱蜡至水。新鲜配制3%H2O2的甲醇液室温处理20 min。用0.01 MPBS洗涤5 min×3次，0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液抗原热修复10 min，自然冷却至室温，0.01 MPBS洗涤5 min×3次，滴加正常山羊血清工作液，37℃，30 min。弃去血清，勿洗。吸干血清，加入一抗 (根据预试验适当稀释，Aβ1-42浓度 1∶400，4℃，40 h。0.01 MPBS洗涤5 min×3次，滴加二抗 (生物素标记二抗工作液)，37℃，2 h，0.01 MPBS洗涤5 min×3次，滴加三抗(辣根酶标记链霉卵白素工作液，S-A/HRP)，37℃，2 h，0.01 MPBS洗涤5 min×3次，滴加显色剂DAB底物溶液 (取1 mL双蒸水，加入DAB试剂盒中的A液一滴，混匀后，再加B、C液各一滴混匀)显色，显色时间5～30 min。自来水冲洗，酒精梯度脱水、二甲苯透明、光学中性树脂封片。阴性对照:以PBS代替一抗，其它处理同上。

1.6 统计学分析

用SPSS 16.0软件包进行统计学处理。水迷宫实验数据采用重复测量的方差分析；多组间比较采用单因素方差分析；组间两两比较，方差齐时用LSD检验，方差不齐时采用Dunnett’s T3检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。免疫组化每组积分光密度数据以“±s”表示，组间比较采用单因素方差分析。对严重偏离正态分布者采用多样本的非参数检验(Kruskal-walls检验)。

2 结果

2.1 各组小鼠行为学改变

回神颗粒治疗组小鼠学习记忆能力提高，与模型组比较，第3～5天逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增多(均P＜0.05)；治疗组穿越平台次数与正常组比较差异无统计学意义(均P＞0.05)。说明回神颗粒治疗组改善了APPswe/PS1dE9双转基因小鼠的行为缺陷，增强了其学习记忆能力。见表1。

表1 各组小鼠隐藏平台实验中逃避潜伏期的比较 （±s，n=10，s）

表1 各组小鼠隐藏平台实验中逃避潜伏期的比较 （±s，n=10，s）

注:与正常组比较△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。下表同。

组别模型组治疗组正常组正常加药组第1天45.34±24.77 28.14±27.21 42.14±25.42 40.73±23.54第2天37.24±25.14 20.88±23.77 41.20±24.93 37.61±23.21第3天26.98±22.72△△10.40±14.35** 25.55±23.86 18.66±16.58第4天25.38±23.89△△8.88±13.54** 6.95±7.02 5.58±6.07第5天19.06±20.64△△9.09±14.28** 4.37±4.28 4.21±3.45

2.2 各组小鼠海马区HE染色结果

正常组小鼠大脑皮层组织结构清楚，各层神经元密集，排列整齐，细胞核膜、核仁清楚，皮层微血管管壁完整。海马CA1区细胞排列整齐均匀，形态规则，细胞结构完整。而模型组小鼠大脑皮层组织结构紊乱，神经元胞体缩小，海马CA1区细胞排列不均匀，细胞周围出现间隙，血管壁不整齐。中药组海马核固缩现象明显减轻，细胞排列较模型组整齐，形态较正常，炎性细胞明显较少，血管结构正常。详见图1-2。

2.3 各组小鼠海马区Aβ1-42表达比较

免疫组化结果显示:Aβ1-42主要表达在神经元，阳性细胞胞质呈深棕色，着色部位于胞膜和胞质，细胞多呈圆性或锥形，胞体较大，突起明显。正常组皮层Aβ1-42阳性细胞数量少、着色浅，模型组皮层Aβ1-42阳性细胞较正常组着色加深，二者相比有显著差异（P＜0.05）。回神颗粒治疗组的Aβ1-42阳性细胞数量大于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表2及图3-4。

3 讨论

回神颗粒是导师陈宝贵教授在长期临床实践中不断总结用药经验的基础上研制而成的治疗AD的有效中药复方制剂，临床上有较好的疗效[4-5]。中医学理论认为，该病为五脏精气虚衰、瘀血和痰浊所致，是本虚标实之证，治疗上需补益五脏之精气，兼以化瘀祛痰，开窍通络。回神颗粒，君药为人参，入脾肺两经，大补元气，固脱生津安神。石菖蒲入心、肝、脾三经，开窍豁痰，化湿和中，治神昏、痰厥；鹿角胶温补肝肾，活血消肿，益气通神气，共为臣药。灵芝入脾肾，增强免疫活性；丹参苦凉入心 肝，消离经之血，促进血肿吸收；五味子酸温入肺肾，敛气滋阴，生津止汗，收敛耗散之精气，改善智力活动，促进基础代谢，共为佐药。丹参的苦凉可牵制人参、鹿角胶、石菖蒲的温燥，五味子的酸敛能抑制石菖蒲、川芎辛散太过。使药为川芎，活血行气，上行巅顶，下行血海，引诸药上通下达，归脏腑，入经络。全方诸药，补而不滞，温而不燥，补气活血，醒脑开窍，化痰祛浊。

图1 各组小鼠鼠治疗至6月龄后脑组织病理变化显微图(HE，×100)

图2 各组小鼠鼠治疗至6月龄后脑组织病理变化显微图(HE，×200)

图3 各组小鼠鼠治疗至6月龄后脑组织免疫组化图(Aβ1-42，×100)

图4 各组小鼠鼠治疗至6月龄后脑组织免疫组化图(Aβ1-42，×200)

表2 回神颗粒对APP/PS1双转基因小鼠大脑海马CA1区Aβ1-42表达的影响（Mean±SD，n=10，个）

AD患者的学习记忆能力减退是老年痴呆的核心症状，严重影响着老年人的生活质量。AD病理表现在大脑皮层和皮层下特定脑区神经元和突触的大量死亡和缺失，导致相应脑区萎缩，如颞叶、顶叶、前额及扣带回叶萎缩[6]，利用MRI或PET可明显观测到与健康人相比出现体积减少、形状改变等现象[7]。从生化水平分析，在显微镜下可明显观测到淀粉样沉积 （senile plaques，SP）和神经纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFT)[8]。其中，SP主要组成是Aβ多肽片段，Aβ来于淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）。APP是跨膜蛋白，在神经元生长、突触传递等起重要作用[9]。AD中多种蛋白异常均可导致APP被酶剪切至小片段[10]，其中的某些片段如Aβ1-42积累引起淀粉样沉积[11]。目前，尚缺乏有效的治疗方法来阻止或逆转该病的进展。中药复方回神颗粒在临床上治疗AD具有较好的疗效。探讨回神颗粒治疗AD的机理，有着十分积极的意义。目前APPswe/PS1dE9双转基因小鼠被认为是较为理想的AD动物模型，其不仅能模拟AD的自然缓慢发病过程，又可以出现AD的特征性病理改变老年斑。因此本研究使用APPswe/PS1dE9双转基因小鼠为AD动物模型，通过Morris水迷宫实验检测APPswe/PS1dE9双转基因小鼠的学习记忆能力及中药复方回神颗粒对其学习记忆能力的干预作用，为进一步实验提供研究依据。

本部分实验经免疫组化及HE染色发现，与同背景同年龄野生型C57BL/6J小鼠相比，APPswe/ PS1dE9双转基因小鼠大脑海马区有明显的Aβ的沉积。该结果符合本研究要求。其次，本部分研究发现回神颗粒（连续灌胃3个月）能显著降低APPswe/ PS1dE9双转基因小鼠脑组织 Aβ的沉积，该结果经免疫组化和HE染色均验证。有实验研究报道某药物能改善正常老化 C57BL/6J小鼠（17-20月龄）的记忆能力，但是不能改善 12-15月龄5X FAD转基因鼠[12]。因此，本研究选择连续3个月给药治疗的方式，同时观察APPswe/PS1dE9双转基因小鼠的病理及行为学变化，研究结果较为满意，提示药物早期干预的重要性。

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（本文编辑 匡静之）

Effects of Huishen Granule on Expression of Aβ1-42 in Hippocampus of Double-Transgenic AD Mice

Yu-Ling Zhang1,Bao-Gui Chen2*
（1.Tianjin University of Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;
2.Wuqing TCM Hospital,Tianjin 301700,China）

Objective To explore the therapeutic effect of Huishen granule on early-stage Alzheimer's disease (AD)in transgenosis AD mice.Methods The genotyping of amyloid precursor protein/presenilin 1(APP/PS1)in double-transgenic AD mice were detected by PCR method.The 3-month male transgenic PAD mice and male C57BL/6J wild-type mice with same background were selected as experimental objectives.The ability of learning and memory of the rats were evaluated by escape latency and crossing times of Morris water maze.Themorphology changes in the brains of AD mice were observed by using Hematoxylin-Eosin(HE)staining method.β-amyloid protein 1-42（Aβ1-42)in the area of hippocampus was detected by immunohistochemical method.Results Compared with the model group，the learning and memory ability in the Huishen granule treatmentgroup was increased,the escape latency was shorten and crossing times was increased(P＜0.05);The crossing times in the treatment group were not significantly different from those in the normal group(P＞0.05);The positive area of Aβ1-42 expression hippocampus in the treatment group were reduced(P＜0.05).Compared with the model group，the positive area of Aβ1-42 expression in hippocampus of the model group were increasedobviously(P＜0.05).Conclusion The Huishen granule could significantly improve the learning and memory ability in APP/PS1 double-transgenic AD mice and inhibit the over expression and accumulation of Aβ1-42.

Alzheimer's disease;APP/PSl transgenic mice;Huishen granule;Aβ1-42;ginseng;Acorus gramineus;deerhorn glue

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.08.007

2015-02-25

全国名老中医传承工作室建设项目［国中医药人教发（2011）41］。

张玉岭，女，博士，医师，研究方向:中医治疗脑病。

*陈宝贵，男，主任医师，E-mail:niki19860717＠163.com。