微波辅助提取牛蒡多酚和黄酮工艺优化及抗氧化活性的研究

蔡茜彤,范金波,冯叙桥,侯 宇

(渤海大学食品科学研究院,辽宁省食品安全重点实验室,辽宁锦州 121013)

微波辅助提取牛蒡多酚和黄酮工艺优化及抗氧化活性的研究

蔡茜彤,范金波*,冯叙桥*,侯 宇

(渤海大学食品科学研究院,辽宁省食品安全重点实验室,辽宁锦州 121013)

对牛蒡总酚与黄酮的微波提取工艺和抗氧化活性进行了研究。在单因素实验基础上,用Box-Behnken设计,采用3因素3水平的响应面分析方法优化牛蒡多酚提取工艺。依据数据的模型拟合和回归分析,确定乙醇浓度和料液比是影响总酚得率的重要因素,乙醇浓度是影响黄酮得率的重要因素,并最终获得微波辅助提取牛蒡总酚和黄酮的最佳工艺条件为:微波功率140W、乙醇浓度72%、料液比1∶36(g/mL)、提取时间2.5min,在此条件下总酚含量可达129.68mg/g,黄酮含量可达23.56mg/g。抗氧化实验结果表明:牛蒡多酚提取物具有一定的金属离子螯合能力(IC500.288mg/mL)和较强的DPPH自由基清除能力(IC501.12mg/mL)。

牛蒡,总酚,黄酮,微波,响应面,抗氧化活性

牛蒡(ArctiumlappaL.)属桔梗目,菊科二年生草本植物,牛蒡在温带广泛分布,我国东北、华北、西北地区,华东、华中、西南部分均有种植[1]。牛蒡根含丰富的菊糖及挥发油、多种多酚物质、牛蒡酸、多种醛类,并富含纤维素及各种人体必需的氨基酸[2]。国内外对于牛蒡活性成分的研究以菊糖为主,而对于多酚的研究相对较少。

娄在祥[3]利用超声微波辅助提取牛蒡叶多酚,并鉴定了牛蒡叶的十一种活性成分,包括槲皮素、槲皮苷、咖啡酸、绿原酸、芦丁、苯甲酸等,且研究发现牛蒡多酚提取物有着与合成抗氧化剂TBHQ相近的抗氧化活性。Wang[4]等研究表明牛蒡根甲醇提取物及其主要成分绿原酸和咖啡酸可以抑制低密度脂蛋白氧化。Ku[5]和Liu[6]等报道牛蒡多酚提取物对于幽门螺杆菌引发的胃溃疡有辅助治疗作用。Mikami-Konishide等[7]研究日本的71种果蔬多酚提取物清除氧自由基的能力,发现牛蒡多酚提取物清除氧自由基的能力仅次于长果种、紫苏和空心菜位于第四位。

随着人们生活水平的提高,对于食品的要求也越来越高,更倾向于食用富含功能活性成分的食品。天然来源的多酚成分具有多样的生物学活性,对人类的健康起着非常重要的作用。本文以牛蒡根为原料,利用微波辅助提取牛蒡多酚,优化了提取条件,探讨了牛蒡多酚的抗氧化活性,为其进一步的开发应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牛蒡 徐州大自然公司；2,2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH) 百灵威科技有限公司；菲洛嗪(Ferrozine) 合肥博美生物有限公司；Folin-Ciocalteu试剂 天津市光复精细化工研究所；其余试剂 均为分析纯。

RRH-A500高速多功能粉碎机 上海缘沃工贸有限公司；FD-1-55真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；UV-2700紫外-可见光分光光度计 日本SHIMADZU公司；JA5003电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；Centrifuge5804-R冷冻离心机 德国eppendorf公司；G70F23CN2P-BM1(SO)微波炉 广东格兰仕微波炉电器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牛蒡预处理 将新鲜牛蒡清洗切片并于0.5%抗坏血酸溶液中浸泡30min[8],沥干切碎后,40℃烘干恒重,粉碎,过筛,制得牛蒡干粉。

1.2.2 单因素实验设计

1.2.2.1 乙醇浓度对牛蒡多酚和黄酮得率的影响 分别选用0%、20%、40%、60%、80%、100%浓度的乙醇作为溶剂,在提取时间为3min、料液比为1∶20(g/mL)、微波功率140W条件下,研究乙醇浓度对牛蒡多酚得率的影响。

1.2.2.2 料液比对牛蒡多酚和黄酮得率的影响 选取料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55、1∶60(g/mL),在乙醇浓度70%、提取时间3min、微波功率140W条件下,研究料液比对牛蒡多酚得率的影响。

1.2.2.3 微波功率对牛蒡多酚和黄酮得率的影响 选取微波功率分别70、140、210、280、350、420W,在70%乙醇浓度、提取时间为3min、料液比为1∶20条件下,研究微波功率对牛蒡多酚得率的影响。

1.2.2.4 提取时间对牛蒡多酚和黄酮得率的影响 选择提取时间为1、2、3、4、5、6min,在乙醇浓度为70%、料液比为1∶20、微波功率140W条件下,考察不同时间对牛蒡多酚得率的影响。

1.2.3 响应面实验设计 通过单因素实验结果,选取乙醇浓度、料液比和微波时间为3个考察因素,利用Box-Behnken设计方法,选三个中心点进行15个实验,并对实验数据进行多项式回归分析,建立二次响应回归模型,拟合得到二次回归方程,实验因素与水平见表1。

1.2.4 总酚与黄酮含量的测定

1.2.4.1 总酚含量的测定 总酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu法测定[9]。以没食子酸为基准物质,制作标准曲线得到吸光度与总酚质量浓度的方程:y=0.00435x+0.0009(R2=0.9989)。

表1 Box-Behnken设计实验因素水平表Table 1 Factors and levels of box-behnken design

取1mL牛蒡提取液加入25mL比色管中,依次加入福林-酚试剂0.2mL,15% Na2CO3溶液2mL,去离子水定容,室温下静置60min,于765nm下测定吸光度,测得的吸光度代入标准曲线,求得试样中总酚浓度,并计算牛蒡总酚含量。

式中:c为比色管中牛蒡总酚浓度(μg/mL)；v1为比色管量程(25mL)；v2为反应体系中牛蒡提取液体积(1mL)；v为总酚提取液总体积(mL)；m为牛蒡粉质量(g)。

1.2.4.2 黄酮含量的测定 黄酮含量的测定采用NaNO2-Al(NO3)3法测定[10]。以芦丁为标品,制作标准曲线得到吸光度与黄酮质量浓度的方程:y=0.0131x-0.0001(R2=0.9987)。取1mL牛蒡提取液加入25mL比色管中,加入5%NaNO2溶液0.4mL摇匀,静置6min,再加入10%Al(NO3)3溶液0.4mL摇匀,静置6min,最后加入4%NaOH溶液4.0mL,加去离子水稀释至刻度,室温静置15min,测定509nm处吸光值,代入标准曲线,求得试样中黄酮浓度,并计算牛蒡黄酮含量。

式中:c为比色管中牛蒡黄酮浓度(μg/mL)；v1为比色管量程(25mL)；v2为反应体系中牛蒡提取液体积(1mL)；v为黄酮提取液总体积(mL)；m为牛蒡粉质量(g)。

1.2.5 金属离子螯合能力 将牛蒡提取液真空浓缩,真空冷冻干燥,得牛蒡提取物粉末,用70%乙醇将待测的牛蒡提取物溶解成系列溶液。参照Gulcin等[11]的测定方法,以EDTA为阳性对照,向2.4mL系列浓度的牛蒡提取物溶解液中依次加入现配的30μL2mmol/L的FeCl2溶液和60μL5mmol/L的菲咯嗪溶液,混合均匀后室温静置10min,测定混合液在562nm处的吸光值,以等量的超纯水代替样品溶液作为空白对照。以样品浓度为自变量,自由基清除率为因变量作图并进行线性拟合,计算IC50值,其中IC50值定义为清除率为50%时所需抗氧化剂的浓度,所需浓度越低,表明该物质金属离子螯合能力越强[12]。

金属离子螯合率(%)=(1-AS/A0)×100,其中:AS为样品管的吸光值；A0为对照管的吸光值。

1.2.6DPPH自由基清除活性 称取9.85mgDPPH以无水乙醇定容至250mL作为DPPH工作液,在反应体系中,于10mL试管中加入200μL系列浓度的牛蒡提取物溶解液,再加入2mLDPPH工作液,振荡摇匀,于室温下避光静置30min,测定517nm处的吸光值,以加入等量的乙醇作为空白对照[13]。以样品浓度为自变量,自由基清除率为因变量作图并进行线性拟合,计算IC50值。

DPPH自由基清除率(%)=(1-AS/A0)×100,其中:AS为样品管的吸光值；A0为对照管的吸光值。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇浓度对牛蒡多酚和黄酮得率的影响 由图1可知,随乙醇浓度的增大,总酚和黄酮的得率呈现先增大后减小的趋势,体积分数为80%时,总酚和黄酮得率均较大,此后随乙醇体积分数的增加,总酚和黄酮得率下降,总酚的下降趋势尤为剧烈。这可能是由于在较低浓度范围内,随着浓度增大,多酚与多糖、蛋白质等物质之间的氢键和疏水作用力越容易断裂,多酚得率提高[14],但乙醇浓度过大时,由相似相容原理,不易于水溶性多酚的提取,而牛蒡中水溶性多酚含量丰富,使得总酚和黄酮提取率骤降。据此,乙醇浸提法较适宜的乙醇浓度为80%。

图1 乙醇浓度对牛蒡总酚和黄酮提取量的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of polyphenols and flavones in burdock

2.1.2 料液比对牛蒡多酚和黄酮得率的影响 料液比对多酚和黄酮提取率的影响如图2所示,总酚和黄酮得率随着料液比的增大呈现先增加后减小趋势,总酚得率在料液比1∶45(g/mL)时达到最大,黄酮得率在料液比1∶40(g/mL)时达到最大。从成本和精提处理难易分析确定料液比1∶40为宜。

图2 料液比对牛蒡总酚和黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of liquid ratio on the yield of polyphenols and flavones in burdock

2.1.3 微波功率对牛蒡多酚和黄酮得率的影响 微波功率对牛蒡多酚和黄酮提取效果的影响如图3所示。由图3可知随着微波功率的增加牛蒡总酚含量呈现先增加后急剧下降的趋势；由SPSS统计分析可知微波功率为70W和140W时,黄酮得率没有显著差异(p>0.05),微波功率为140W和210W时,黄酮的率有显著差异(p<0.05),结合图3可知,在所选微波范围内,黄酮得率呈现先不变后下降趋势。总酚得率先增加可能是因为微波功率加大时,微波加热速度加快,多酚溶解速度提高,从而加速了多酚由细胞到溶液中的转移,当微波功率增大到一定程度时,总酚和黄酮得率迅速下降,这可能是因为高微波功率产生的局部高热破坏了部分多酚成分[15]。综合考虑总酚和黄酮的得率以及黄酮得率的变化趋势,确定最佳微波功率为140W，且在响应面优化实验中不再考虑该因素。

图3 微波功率对牛蒡总酚和黄酮提取量的影响Fig.3 Effect of microwave power on the yield of polyphenols and flavones in burdock

2.1.4 提取时间对牛蒡多酚和黄酮得率的影响 如图4所示,总酚和黄酮得率呈现先增加后减小趋势,总酚得率在3min时达到最大,黄酮得率在4min时达到最大。这可能是因为细胞破裂、多酚物质的溶出需要时间,随着提取时间的延长,多酚能被充分提取,但时间过长,多酚物质可能被微波巨大的机械能所破坏,从而使得多酚得率下降[16]。综上,综合考虑多酚和黄酮的得率,确定最佳提取时间为3min。

图4 提取时间对牛蒡总酚和黄酮提取量的影响Fig.4 Effect of extraction time on the yield of polyphenols and flavones in burdock

2.2 响应面法优化牛蒡多酚和黄酮提取工艺结果分析

响应面分析方案与结果见表2。利用Design-Expert 8.0.6软件对表3实验数据进行线性拟合,获得微波辅助提取牛蒡总酚含量(Y1)和黄酮含量(Y2)对乙醇浓度(X1)、料液比(X2)、提取时间(X3)的二次回归模型方程分别为:

Y1=-1158.63+29.27X1+4.29X2+65.66X3+0.02X1X2-0.17X1X3-0.03X2X3-0.20X12-0.07X22-8.24X32

Y2=-352.45+8.30X1+1.44X2+22.84X3+2.5E-004X1X2-0.07X1X3+9.38E-0.03X2X3-0.05X12-0.018X22-2.80X32

表2 Design-Expert实验设计方案及结果Table 2 Design-Expert design scheme and experimental results

表3 总酚方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)of total polyphenols

表4 黄酮方差分析Table 4 Analysis of variance(ANOVA)of flavones

注:**表示差异极显著(p<0.01);*表示差异显著(p<0.05)。

由于因素之间交互作用不显著,以固定提取时间为0水平的响应面分析图为例,探讨因素水平的变化对牛蒡总酚(见图5)和黄酮(见图6)含量影响。如图5所示的响应面为开口向下的凸形曲面,有极高值,在一定范围内,总酚得率随乙醇浓度与料液比的增加而增高,乙醇浓度较料液比方向的曲面更陡峭,说明乙醇浓度对总酚含量的影响更为显著,与方差分析表中结果一致[17]。分析图6,乙醇浓度和料液比对牛蒡黄酮得率影响的响应面分析图可得类似结果。

图5 Y1=f(X1,X2)的响应面图Fig.5 Response surface of Y1=f(X1,X2)

图6 Y2=f(X1,X2)的响应面图Fig.6 Response surface of Y2=f(X1,X2)

2.3 验证实验

由软件分析得,最佳提取条件为乙醇浓度72.18%、料液比1∶36.30(g/mL)、提取时间2.66min,在此最优条件下总酚含量可达132.68mg/g,黄酮含量可达24.63mg/g。结合实际操作,确定提取条件为:微波功率140W、乙醇浓度72%、料液比1∶36(g/mL)、微波提取时间2.5min,采取该工艺得到牛蒡总酚含量为129.68mg/g,牛蒡黄酮含量为23.56mg/g。与理论值相比误差分别为2.26%和4.34%,说明Design-Expert实验设计有效的对微波辅助提取牛蒡多酚的条件进行了优化。

2.4 牛蒡提取物的抗氧化活性

2.4.1 金属离子螯合能力 将牛蒡提取物粉末用70%乙醇配制成0～1.0mg/mL溶液,不同浓度牛蒡提取物的金属离子螯合能力如图7(a)所示,金属离子螯合率随牛蒡提取物溶液浓度的增加而增大最后趋于水平,当浓度为0～0.4mg/mL时,金属离子螯合能力近似线性增加,对该区间线行拟合可得牛蒡提取物螯合金属离子的IC50值为0.288mg/mL,类似的,由图7(b),当EDTA浓度为0～0.007mg/mL时,金属离子螯合能力呈线性增加,通过线性拟合得到EDTA螯合金属离子的IC50值为0.0058mg/mL,说明牛蒡提取物具有一定的金属离子螯合能力。

图7 不同浓度牛蒡提取物(a) 和EDTA(b)的金属离子螯合能力Fig.7 Ferrous ions chelating activity of different concentrations of burdock extraction and EDTA

2.4.2 DPPH自由基清除能力 将牛蒡提取物用70%乙醇配制成不同浓度的溶液,不同浓度牛蒡提取物溶液的DPPH自由基清除能力见图8。如图所示,在选定浓度范围内,牛蒡提取物对DPPH清除率呈线性关系增加,R2=0.9969,据此可以计算出牛蒡提取物清除DPPH自由基的IC50值为1.12mg/mL,笔者前期研究中得到合成抗氧化剂BHT清除DPPH自由基IC50值为0.36mg/mL[18],可见牛蒡提取物有较强的DPPH自由基清除能力。曹旭等[19]研究牛蒡根黄酮提取物清除DPPH自由基的IC50值为15.7mg/mL,远高于本实验研究结果,差距较大可能是因为牛蒡原料本身的抗氧化性差异,也可能是因为微波辅助作用提高了多酚和黄酮的得率。

图8 不同浓度的牛蒡提取物 对DPPH自由基清除率的线性拟合结果Fig.8 Dose-dependent inhibition of burdock extraction on DPPH free radicals and its linearity correlation

3 结论

在单因素实验结果的基础上,使用Design-Expert 8.0.6软件优化微波辅助提取牛蒡多酚的提取工艺,结合实际操作确定最佳实验条件为微波功率140W、乙醇浓度为72%、料液比1∶36(g/mL)、提取时间为2.5min,在此条件下,牛蒡总酚含量达129.68mg/g,牛蒡黄酮含量达23.56mg/g。体外抗氧化实验研究表明:牛蒡提取物具有一定的金属离子螯合能力,IC50值为0.288mg/mL,具有较强的DPPH自由基清除能力,IC50值为1.12mg/mL。

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Optimization of process for microwave-assisted extractionof polyphenols from burdock and its antioxidant activity

CAI Xi-tong,FAN Jin-bo*,FENG Xu-qiao*,HOU Yu

(Food Science Research Institute of Bohai University,Food Safety Key Lab of Liaoning Province,Jinzhou 121013,China)

The microwave-assisted extraction process and antioxidant activity of total phenols and flavones from burdock were studied. To optimize the process of polyphenol extraction from burdock,the response surface methodology with three factors at three levels was adopted on basis of single factor experiments. Model fitting and regression analysis of experimental data showed that two significant factors which influenced total phenol yields were ethanol concentration and liquid ratio,and one significant factor which influence flavone yields was ethanol concentration. The results showed that the optimal extraction conditions were the presence of microwave power 140W,72% ethanol solvent,extraction time 2.5 minutes and liquid ratio 1∶36g/mL. Under the optimal conditions,the yield of total phenols and flavones from burdock reached 129.68mg/g and 23.56mg/g respectively. The polyphenol extraction from burdock showed a certain ferric ions chelating ability(IC500.288mg/mL)and strong DPPH radical scavenging activity(IC501.12mg/mL).

burdock;total phenol;flavone;microwave;response surface;antioxidant activity

2014-06-30

蔡茜彤(1989-)，女，在读研究生，研究方向：农产品加工及贮藏工程。

*通讯作者:范金波(1977-)，男，博士，讲师，主要从事食品生物化学方向的研究。 冯叙桥(1961-)，男，博士，教授，研究方向：农产品加工及贮藏工程。

辽宁省食品安全重点实验室开放课题项目(LNSAKF2013017)。

TS201.2

B

1002-0306(2015)03-0275-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.049