小鼠骨髓源性树突状细胞体外诱导培养体系的构建

刘振明，胡何节，方征东，王晓天，孙小杰，葛新宝

◇技术与方法◇

小鼠骨髓源性树突状细胞体外诱导培养体系的构建

刘振明，胡何节，方征东，王晓天，孙小杰，葛新宝

建立一种体外诱导培养小鼠骨髓源性的树突状细胞（DCs）方法，在镜下可观察到培养出的未成熟树突状细胞（imDCs）比成熟树突状细胞（mDCs）细胞突起少。流式细胞术检测CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子在imDCs的表达显著低于在mDCs上的表达。同种异基因混合淋巴细胞反应显示DCs刺激T细胞增殖的能力随着DCs所占比例的增大而增强，在相同比例条件下对刺激T细胞增殖的能力，imDCs显著低于成熟mDCs。该诱导方法可获得大量符合科研要求的小鼠骨髓源性DCs。

小鼠；树突状细胞；细胞培养

目前的研究［1］认为动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的发生、发展到转归是一种慢性炎症反应的病理过程，有大量的免疫细胞和炎症介质参与其中。树突状细胞（dendritic cells，DCs）作为目前已知的体内功能最强的专职抗原提呈细胞（antigen－presenting cell，APC），也是唯一能在体内直接激活初始T细胞的抗原提呈细胞，其在诱导T淋巴细胞活化，刺激初始T淋巴细胞增殖、介导免疫耐受等方面发挥着重要作用［2］。该研究通过提取小鼠骨髓细胞体外培养DCs，旨在为后续其在AS小鼠模型上进行其免疫功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性C57BL／6小鼠和BALB／c小鼠，6～8周龄，约20 g，清洁级，购自安徽医科大学实验动物中心。

1.1.2 主要试剂 南美胎牛血清（fetal calf serum，FCS）购自美国Hyclone公司；RPMI 1640全培养液购自美国Gibco公司；重组小鼠粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（recombinantmurine granulocyte macrophage colony stimulating factor，rmGM-CSF）及重组小鼠白介素-4（recombinant murine interleukin-4，rm IL-4）购自美国Peprotech公司；脂多糖（lipopdysaccharide，LPS）及甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）购自美国Sigma公司；小鼠流式单克隆抗体FITC-CD11c、PE-CD80、PE-CD86、PEMHC-Ⅱ及其同型对照抗体购自美国eBioscience公司。

1.1.3 主要仪器 流式细胞仪购自美国BD公司；倒置显微镜购自日本Olympus公司；Thermo恒温培养箱购自美国Thermo公司；酶标仪购自美国BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓源性DCs的分离、培养及诱导将C57BL／6小鼠颈椎脱臼法处死，无菌条件下取出双侧股骨、胫骨，仔细剥离附着的肌肉组织，用PBS反复洗涤，无菌剪刀剪去骨干两端，1 ml注射器抽取RPMI 1640全培养液反复冲洗骨髓腔直至变白，冲洗液经400目滤网过滤去除组织碎片，收集细胞悬液至15 m l离心管中，以1 200 r／min离心5 min，去除上清液，用含12%FCS的RPMI 1640全培养液配成细胞悬液，细胞计数板计数，调整细胞浓度为5 ×105／ml，加入rmGM-CSF（终浓度20 ng／m l）及rm IL-4（终浓度20 ng／ml），分装于培养瓶，置入37℃、5%CO2培养箱中培养。48 h后收集悬浮细胞，1 200 r／min离心5 min，去除上清液，补充含12% FCS的RPMI 1640全培养液及rmGM-CSF、rm IL-4细胞因子，以后隔日半量换液，第5天将收集的悬浮细胞分成两组，一组在培养液中加入LPS（1μg／ml）刺激成熟，培养至第7天收集悬浮细胞，流式细胞术检测其表面共刺激分子的表达，另一组不做LPS刺激处理，培养至第7天收集悬浮细胞，流式细胞术检测其表面共刺激分子的表达。

1.2.2 细胞形态学观察 倒置显微镜下动态观察DCs的形态及数量的变化并摄影记录。

1.2.3 流式细胞术检测DCs表面分子 分别收集两组细胞离心后去上清液，将约4×105个DCs悬于300μl PBS，按照流式抗体说明书进行抗体标记及同型对照标记，4℃避光孵育30 min，加1 m l PBS洗涤离心，重悬于300μl PBS中，流式检测两组细胞表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表达情况。

1.2.4 MTT法检测同种异基因混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction，MLR） 颈椎脱臼法处死BALB／c小鼠，无菌条件下取出其脾脏，剪碎研磨经400目滤网过滤，得到细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离出单核细胞，尼龙毛柱法获得同种异体T细胞作为反应细胞，调整密度为2×106／ml。取上述方法获得的C57BL／6小鼠骨髓性未成熟树突状细胞（immature dendritic cells，imDCs）和成熟树突状细胞（mature dendritic cells，mDCs），加入终浓度为25μg／ml的丝裂霉素C，37℃孵育45 min，PBS洗涤2遍，按照DC∶T细胞比例为1∶5、1∶10、1∶20、1∶40的反应比铺于96孔板中，每个比例设置3个复孔，设单纯的DC细胞和单纯T细胞为阴性对照组，设培养液为空白对照组，在37℃、5% CO2条件下共培养72 h，共培养结束前4 h，在每孔中加入20μl MTT继续培养4 h，每孔吸取培养液后加入150μl的DMSO，室温震荡10min，酶标仪测定各孔的吸光度（absorbance，A）值，检测波长为570 nm。刺激指数（stimulation index，SI）＝（待测样品孔A值－培养液对照组A值）／（阴性对照组A值－培养液对照组A值）。

1.3 统计学处理采用SPSS 19.0统计软件对数据进行单因素方差分析，数据以±s表示。

2 结果

2.1 倒置显微镜下动态观察DCs的形态及数量的变化倒置显微镜下可见细胞在开始的48 h内呈贴壁生长，细胞体积较小，有少量的细胞聚集现象。培养48 h后，部分细胞开始出现半悬浮状态，并形成细胞集落，少量细胞表面出现毛刺状突起。培养的第5天镜下观察可见大量细胞集落，细胞集落表面可见大量长短不一的突起，细胞体积进一步增大，呈悬浮状态。加入LPS刺激48 h后，可见大量毛刺状突起的DCs从集落释放出来，呈游离状态，而未加LPS刺激的DCs仍呈集落聚集生长。见图1。

2.2 流式检测DCs表面分子细胞培养第7天分别收集两组细胞，用流式细胞术分析其表面分子的表达情况。结果显示，两组细胞均高表达CD11c分子，纯度＞90%。未加LPS刺激组的DCs低表达CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子，细胞表现为未成熟状态，而在LPS刺激组这些表面分子则呈现出明显的高表达，细胞表现为成熟状态。见图2。

2.3 M TT法测两组DCs对同种异基因T细胞的刺激增殖能力单因素析因方差分析结果显示两组DCs刺激T细胞增殖的能力随着DCs所占比例的增大而增强，在相同比例条件下，imDCs刺激T细胞增殖的能力显著低于mDCs刺激T细胞增殖的能力，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 M LR中im DCs和mDCs对T细胞的SI

表1 M LR中im DCs和mDCs对T细胞的SI

组别n DC∶T细胞比例1∶5 1∶10 1∶20 1∶40 F值P值imDCs 3 1.38±0.04 1.29±0.02 1.16±0.04 1.04±0.06 39.243 0.000 mDCs 3 2.35±0.07 1.95±0.05 1.43±0.02 1.31±0.11 149.699 0.000 F值504.0 410.2 129.3 14.8 P值0.000 0.000 0.000 0.020

3 讨论

本实验采用Lutz et al［3］创建的小鼠骨髓性DCs培养方法，利用细胞的悬浮性能去除贴壁的单核细胞，收集培养液中的悬浮细胞，可筛选出高纯度的DCs。对于诱导体系所采用的细胞因子浓度，不同的文献报道差异较大，本实验在培养过程中发现，在rmGM-CSF浓度为20 ng／ml时DCs即可有比较满意的获得率，随着细胞因子浓度的增加，DCs的获得率并没有明显增加，而当rmGM-CSF浓度达到100 ng／ml时，imDCs培养体系中imDCs所占的比例反而减少，mDCs所占比例增加，该结果与先前的文献［4－5］报道一致。

DCs通过不同的成熟状态改变细胞表面分子的表达及细胞因子的分泌，调节抗原特异性T细胞向不同亚群分化，参与免疫应答和免疫耐受的发生。其免疫原性和耐受性双重功能主要与其表达共刺激分子相关，在免疫应答过程中，APC将抗原提呈给T淋巴细胞需要两个信号的参与，第一信号由APC表面的抗原肽-MHCII类分子复合物与TCR相互作用，诱导T淋巴细胞的活化，第二信号则是由CD80、CD86等协同刺激分子共同调节T淋巴细胞的增殖活化［6］。本研究显示，imDCs组中CD80、CD86等协同刺激分子和MHC-Ⅱ类分子呈现出低表达，抗原提呈能力较弱，T淋巴细胞活化信号受阻，此时的DCs表现为免疫耐受状态，而在mDCs组中CD80、CD86等协同刺激分子和MHC-Ⅱ类分子表达明显升高，MLR实验显示，mDCs对同种异基因的T细胞刺激能力明显高于imDCs。刺激成熟后的DCs调节T淋巴细胞的活化，参与机体免疫应答，而未刺激成熟的DCs在体内下调免疫应答和维持免疫耐受，又称之为耐受性树突状细胞（tolerogenic dendritic cells，tolDCs）。本实验从细胞形态、分子表达和MLR三个方面鉴定培养体系中imDCs和mDCs的形态和功能特点，可以判定培养出的DCs符合科研要求。

有文献［7］报道，尽管在人和老鼠的正常动脉上也能发现DCs，但当这些血管发生动脉粥样硬化时，DCs在数量和分布上会发生很大的改变。本课题组的前期研究［8］显示，在人颈动脉粥样硬化血管中免疫原性的CD83＋mDCs的分布增多，而耐受性的CD11b＋tolDCs分布减少。由此可见，DCs的免疫调节作用参与了AS的发生和发展，然而DCs在体内的数量较少，仅占外周单核细胞的1%左右［9］，如此稀少的数量给其免疫功能的研究带来了不小的困难。因此，本实验利用rmGM-CSF及rm IL-4从小鼠骨髓细胞中诱导培养出大量可供研究的DCs，为后续在AS小鼠模型上进行其免疫功能研究创造了有利的条件。

［1］ 任 涛，李枚娟，王 焱.动脉粥样硬化与炎症反应关系的研究进展［J］.中国老年学杂志，2010，30（10）：1464－7.

［2］ 滕广帅，邵宗鸿.树突细胞与自身免疫性疾病关系的研究进展［J］.中华医学杂志，2012，92（12）：859－61.

［3］ Lutz M B，Kukutsch N，Ogilvie A L，et al.An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bonemarrow［J］.JImmunolMethods，1999，223（1）：77－92.

［4］ 李闻颖，邓 锋，王豫蓉，等.不同浓度粒巨噬细胞集落刺激因子在未成熟树突状细胞培养中的效果研究［J］.重庆医科大学学报，2009，34（4）：424－7.

［5］ 王晓婧，梅晓冬.不同浓度粒巨噬细胞集落刺激因子及白介素－4对树突状细胞体外诱导培养的影响［J］.中国临床保健杂志，2014，17（2）：157－9.

［6］ 张安莉，仇 超，徐建青.淋巴细胞膜分子CD160结构与功能的研究进展［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2011，31（4）：380－4.

［7］ Galkina E，Ley K.Immune and inflammatorymechanisms of atherosclerosis［J］.Annual Review of Immunology，2009，27：165－97.

［8］ 邓 琼，胡何节，方征东，等.CD83＋成熟树突状细胞和CD11b＋耐受性树突状细胞在人颈动脉粥样硬化病变中的分布［J］.中国临床保健杂志，2014，17（1）：45－7.

［9］ Steinman R M.The dendritic cell system and its role in immunogenicity［J］.Annu Rev Immunol，1991，9：271－96.

A culture system for dendritic cells induced from murine bonemarrow in vitro

Liu Zhenming，Hu Hejie，Fang Zhengdong，et al
（Dept of General Surgery，The Affiliated Provincial Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230001）

To establish a culture system for dendritic cells（DCs）induced from murine bonemarrow in vitro.Compared with mature DCs，fewer spines were observed in immature DCs under microscopy.The expressions of cell surfacemolecules in immature DCswere significantly lower than those ofmature DCs.MLR indicated T cells proliferation capacities of same-reaction ratio in immature DCs were significantly lower than those in mature DCs.The methods of culturing DCs establised by us can be used in the future experment.

mice；dendritic cells；cell culture

R 654.3

A

1000－1492（2015）08－1177－04

2015－04－14接收

安徽省自然科学基金（编号：1208085MH151、1408085MH177）

安徽医科大学附属省立医院普通外科，合肥 230001

刘振明，男，硕士研究生；

胡何节，男，主任医师，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：huhejie＠hotmail.com