何 旭,黄 成,孟晓明,刘新华,李 俊
以二氢吡唑为先导的新型化合物靶向hTERT抑制SMMC-7721的增殖
何 旭1,2,3,黄 成1,2,3,孟晓明1,2,3,刘新华1,李 俊1,2,3
目的观察以二氢吡唑为先导的新型化合物对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖抑制的影响。方法采用噻唑蓝(MTT)比色法筛选对SMMC-7721细胞株增殖的抑制作用较强的小分子化合物,并用流式细胞周期实验观察化合物对细胞周期的影响,采用改良的端粒重复序列扩增程序(TRAP)实验检测端粒酶的活性,Western blot法检测化合物对hTERT蛋白表达的影响。结果与香豆素类衍生物相对比,新型二氢吡唑类化合物显示出较好的抑制肿瘤细胞增殖的作用;流式细胞周期检测结果显示该化合物通过S期阻滞影响细胞增殖;改良的TRAP实验结果显示该化合物对端粒酶的活性具有较明显的抑制作用;Western blot法结果显示该化合物可以显著降低hTERT蛋白的表达。结论以二氢吡唑为先导的新型化合物具有抑制SMMC-7721细胞的增殖的作用和周期阻滞作用,初步发现这主要是通过靶向hTERT抑制端粒酶的活性实现的。
二氢吡唑;香豆素;人肝癌细胞株SMMC-7721;增殖抑制;hTERT
人端粒酶是由人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)、人端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)以及人端粒酶相关蛋白(human telomerase-associated protein1,hTP1)等部分组成。研究[1-2]显示端粒酶与肿瘤细胞的永生性关系密切。而肿瘤细胞的永生性是导致肿瘤发生发展的关键因素。因此,近年来端粒酶已成为抗肿瘤药物筛选的新靶点,但由于其结构的复杂性至今仍未找到一个既高活性又高选择性的先导结构。端粒酶的3个亚单位中,hTR和hTP1在癌细胞中为高表达,在癌旁组织内也有表达;然而hTERT仅在癌细胞内高表达,在癌旁组织内表达极少,且其表达水平与端粒酶活性及肿瘤的恶性程度呈正相关性[3-4]。因此,设想以端粒酶结构明确部位hTERT为靶点将能取得更好的抑制肿瘤效果。据此,该课题设计合成了以二氢吡唑及新型香豆素类衍生物等一系列小分子化合物经过筛选以寻找可以通过靶向hTERT抑制肿瘤细胞增殖的小分子化合物。
1.1 主要材料
1.1.1 细胞株 人肝癌细胞株SMMC-7721、人肝癌细胞株HepG2、人胃腺癌细胞株(human gastric cancer cell line-7901,SGC-7901)以及人乳腺癌细胞株(michigan cancer foundation-7,MCF-7)均购自中国科学院上海细胞库。
1.1.2 试剂 胎牛血清(杭州四季青公司);RPMI-1640培养基(美国Hyclone公司);胰酶细胞消化液(上海碧云天生物技术有限公司);hTERT兔抗人单克隆抗体(英国Abcam公司);小鼠抗β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司);蛋白上样缓冲液、蛋白Marker、ECL Western blot Detection化学发光试剂盒(美国Thermo公司);端粒酶活性检测试剂盒(美国Millipore公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒、流式细胞周期试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);5-氟尿嘧啶注射液(5-fluorouracil,5-Fu)(天津金耀氨基酸有限公司);溴化乙锭、3′-叠氮-3′-脱氧胸苷(3′-azido-3′-deoxythymidine,AZT)、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司)。
1.1.3 实验器材 Muliskan MK3型酶标仪(上海雷勃分析仪器公司);SW-CJ-IF型医用超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);2306-Z型细胞培养箱(美国Shellab公司);5415R型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司);Powker Pac Basic电泳仪、半干转仪(美国Bio-rad公司);EPICSXL-MCL型流式细胞仪(美国COULTER公司);WD-9405B型水平摇床(北京沃德生物公司);AF100型制冰机(意大利Scotsman公司);电热鼓风干燥箱(上海市仪器厂)。
1.2 方法
1.2.1 SMMC-7721细胞的培养 用含10%热灭活胎牛血清的RPMI1640培养基,在37℃、5%CO2以及饱和湿度条件下培养,待细胞生长至24 h换液1次,长至密度为70%~80%时进行传代培养,取对数生长期细胞进行实验。
1.2.2 细胞增殖实验
1.2.2.1 实验分组 设置正常组、加药组、5-Fu阳性对照组和DMSO阴性对照组。
1.2.2.2 细胞培养 取对数生长期的SMMC-7721细胞制成约1×105/ml单细胞悬液,每孔加入100 μl接种于96孔板以使每孔约2 000~5 000个细胞,置于37℃、5%CO2的培养箱内孵育6~8 h后加含药的培养基100μl,继续培养48 h后,每孔加入20μl 0.5%现配MTT(5 mg/ml),在细胞培养箱内继续孵育4 h后,终止培养。用5 m l注射器小心吸去孔内的培养液,再在每孔加入150μl的DMSO溶解结晶,室温摇床低速振荡待结晶完全溶解后,于酶标仪490 nm波长处测吸光度(absorbance,A)值。并计算抑制率及IC50值。以空白组作为对照组,其细胞存活率为100%,其余各组按如下公式计算:存活率=(各实验组A值/对照组A值)×100%。重复以上实验操作至少3次。
1.2.3 流式细胞术检测细胞周期 将细胞以1× 104/瓶接种于培养瓶中,培养约12 h后加药处理48 h,弃去培养液,用胰酶适度消化细胞,加入培养基轻轻吹打;转速1 200 r/min离心5 min,收集细胞;用PBS洗2~3遍,加约0.5 ml的PBS缓慢吹匀细胞,离心弃上清液;加约1 ml 70%冷乙醇溶液,-20℃下固定过夜;1 200 r/min离心5 min,收集固定细胞,PBS洗2~3遍;加入碘化丙啶(100μg/m l)和RNase(50μg/ml),置于4℃下避光染色30 min,将流式细胞管中放在流式细胞仪上检测,用ModFit软件分析DNA倍体及细胞周期各时相,所有实验重复至少3次。
1.2.4 端粒酶的活性检测
1.2.4.1 细胞培养及细胞抽提物制备 从RPMI-1640细胞培养液中,收集约106个SMMC-7721细胞,放入1.5 ml的Ep管中,洗涤。4℃用离心机离心5 min(1 200 r/min)后弃除上清液,洗涤2次;然后加入200μl的CHAPS裂解液震荡混匀后,在冰浴中静置30 min后,再用14 000 r/min的转速离心20 min后收集上清液,取出部分检测蛋白浓度后保存于-80℃下。
1.2.4.2 端粒重复序列扩增程序(telomeric repeat amplification protocol,TRAP)实验 取细胞抽提物2.0μl加入5.0μl的10×TRAPReaction buffer、1.0 μl的50×dNTPMix、1.0μl的TSPrimer、1.0μl的TRAPPrimer Mix、0.4μl的Taq Polymerase(5 U/μl)、39.6μl的dH2O共50μl。然后将PCR管置于PCR扩增仪上,30℃下静置30 min,然后进行PCR扩增,94℃变性30 s、59℃退火30 s、72℃延伸1 min,待33个循环后,取PCR扩增产物25μl,利用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后将胶用EB或SYBR(10 mg/ml)染色30 min。拍照观察结果。
1.2.5 Western blot法检测hTERT蛋白的表达
1.2.5.1 蛋白提取 取经给药处理48 h后细胞,用PBS洗涤2~3次后,用吸水纸吸干PBS,在每瓶细胞加入含1%PMSF的RIPA裂解液500μl,于冰上轻轻摇晃30 min后转移到1.5 ml的EP管中,在4℃、12 000 r/min下离心15 min后缓慢吸取上清液至新的1.5 ml EP管后用BCA法进行蛋白定量。再按4∶1的比例加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液于100℃使蛋白变性10 min。
1.2.5.2 实验分组 设置空白对照组、阳性对照组及加药组。
1.2.5.3 Western blot检测实验 将蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳分离后用电转移法将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上。在常温下用5%的脱脂奶粉将转移后的PVDF膜封闭3 h,并用TBST缓冲液清洗3~4次,再在4℃环境下的已稀释适当比例的一抗中孵育过夜。孵育后的PVDF膜经TBST洗涤3~4次后在辣根过氧化物酶标记的二抗(按1∶10 000稀释)中室温孵育1 h,再经TBST洗涤3~4次后用ECL发光试剂盒显影,以β-actin为内参,以各蛋白与β-actin的光密度(optical density,OD)比值表示蛋白的相对表达量。重复实验操作3次以上。
1.3 统计学处理采用SPSS 17.0统计软件进行分析,数据以±s表示,根据研究目的和数据类型不同分别进行t检验、单因素方差分析等统计学分析。
2.1 小分子化合物的设计合成及抗癌活性筛选
2.1.1 小分子化合物的合成 基于合理的药物分子设计的基础,本课题组设计并合成了二氢吡唑及新型香豆素类衍生物共5个,依次命名为2-[3-甲基-1-(4-硝基苯)-4,5-二氢吡唑砜、1-甲基-2,3-吡唑酰胺、N-(2-甲氧基苯基)-2-香豆素-3-酰胺、N′,N′-二己基-2H-香豆素-3-酰胺、6,8-二溴-[3-(三氟甲基)苯基]-2-香豆素-3-酰胺,并分别用代号化合物1、2、3、4、5表示,分子结构式见图1。
2.1.2 化合物抗癌活性筛选 半数抑制浓度(IC50)是指抑制50%细胞增殖时所使用的化合物浓度,其值越小即表明抗癌活性越高。为了观察所合成化合物的抗癌活性,现采用100、20、4、0.8、0.16 μmol/L 5个浓度,在人肝癌细胞株SMMC-7721、人乳腺癌细胞株MCF-7、人胃癌细胞株SGC-7901以及人肝癌细胞株HepG2这4种细胞株上进行初筛。结果显示,化合物1对肿瘤细胞增殖具有较好的抑制作用,尤其是对SMMC-7721细胞株体现出很好的抑制增殖效果。见表1。
表1 化合物1在SMMC-7721、MCF-7、SGC-7901以及HePG2细胞上的IC50值(n=3,±s)
表1 化合物1在SMMC-7721、MCF-7、SGC-7901以及HePG2细胞上的IC50值(n=3,±s)
细胞株IC50(μmol/L)化合物1 5-FU SMMC-7721 4.49±0.33 15.74±0.93 MCF-7 8.15±0.14 33.97±0.82 SGC-7901 58.20±1.67 38.43±1.13 HepG2 5.88±1.14 12.47±0.87
2.2 化合物1对SMMC-7721肝癌细胞增殖的抑制作用
2.2.1 MTT比色法实验结果 通过MTT法实验筛选出的小分子化合物1对SMMC-7721具有较强的抑制增殖的作用,与阳性对照5-FU组相比,其IC50值更低,提示化合物1对SMMC-7721具有较强的抗癌活性作用。
2.2.2 流式细胞周期实验结果 细胞周期实验结果显示小分子化合物1(4.49μmol/L)处理SMMC-7721细胞48 h后,G0/G1期细胞显著减少(F=48.811,P<0.05),S期显著增多(F=783.097,P<0.01),提示化合物1抑制肿瘤细胞增殖,主要是通过阻滞细胞周期于S期实现的。见图2。
2.3 端粒酶活性通过改良的TRAP实验检测SMMC-7721细胞中端粒酶活性以观察化合物1对端粒酶活性的影响,结果显示,化合物1表现出较高的端粒酶活性抑制作用,IC50值为(7.81±1.32)μmol/L,略低于阳性对照药溴化乙锭,IC50值为(2.21±0.50)μmol/L。
2.4 化合物1对SMMC-7721细胞中hTERT表达的影响SMMC-7721在化合物1(4.49μmol/L)和AZT(阳性对照药,20.0 mmol)处理48 h后,阳性对照药AZT组中hTERT的表达量明显下降(F=530.551,P<0.01);化合物1组中hTERT的表达量显著下降(F=106.896,P<0.01),提示化合物1对hTERT的表达具有明显的抑制作用,见图3。
端粒酶自被发现以来,由于其在负责维持的染色体的完整性、细胞永生化以及肿瘤发生发展方面的关键作用而被广泛研究[5]。因此,以端粒酶作为抗肿瘤药物筛选的新靶点也成为了当下研究的热点[6]。其中,作为端粒酶活性的主要限制因素之一的hTERT[7]由于其在癌细胞内高表达但在癌旁组织中表达极少而被认为更适合作为明确部位的靶点。
研究[8-9]发现二氢吡唑类化合物以及香豆素类衍生物是具有多种突出生物活性的先导化合物。最近同时被发现在抑制细胞增殖作用和潜在的抗癌活性方面具有良好的药理学活性[10-12]。因此,在基于合理的药物分子设计的基础上,本研究以端粒酶hTERT蛋白的晶体结构为基础通过计算机模拟、设计并合成一系列新型二氢吡唑类化合物和香豆素类衍生物,并对其进行抗癌活性筛选和初步药理学作用探讨。
体外抗增殖活性实验结果表明受试的5个化合物中,以二氢吡唑为先导的化合物1体现出较好的抑制肿瘤细胞尤其是人肝癌细胞株SMMC-7721增殖的活性。通过进一步的流式细胞周期实验发现在化合物1的作用下SMMC-7721细胞在S期细胞数目显著增多,而在G0/G1期细胞显著减少,提示其主要是通过将细胞阻滞在S期而发挥抑制人肝癌细胞增殖的作用。而改良的TRAP实验显示其对端粒酶的活性抑制作用明显,同时Western blot法结果显示化合物可以显著降低hTERT蛋白的表达。
综上所述,本课题组设计合成的化合物1通过靶向hTERT抑制端粒酶活性和hTERT蛋白表达,并阻滞细胞周期于S期,最终抑制SMMC-7721细胞增殖。这些结果对我们进一步合理优化设计二氢吡唑类化合物以寻找更有效的端粒酶抑制剂指明了方向。然而化合物1是如何通过靶向hTERT产生抑制细胞增殖作用的具体药理学机制尚不明确,仍需要进一步深入探讨。
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Novel compound containing dihydropyrazolemoiety inhibits the proliferation of SMMC-7721 by targeting hTERT
He Xu1,2,3,Huang Cheng1,2,3,Meng Xiaoming1,2,3,et al
(1School of Pharmacy,Anhui Medical University,2Institute of Liver Diseases of Anhui Medical University,3Anhui Institute of Innovative Drugs,Hefei 230032)
Objective To investigate the inhibitory effect of novel compound containing dihydropyrazole moiety on the proliferation of SMMC-7721 by targeting hTERTmelittin.MethodsThe inhibition rate of proliferation of cells treated with novel compoundswasmeasured by MTTassay.And the novel compounds’effecton cell cycle was tested by flow cytometry cell cycle experiment.Telomerase activity was determined throughmodified Telomeric Repeat Amplification Protocol(TRAP)assays.The protein expression level of hTERT was observed by Western blot.ResultsCompared with the heterocyclic compounds,novel compound containing dihydropyrazolemoiety had obvious inhibitory effect on the proliferation of cell lines,especially on the human hepatoma cell line SMMC-7721.The result of flow cytometric cell cycle analysis showed that the number of cells in Sphase wasmarkedly increased.After the treatmentwith novel compound containing dihydropyrazolemoiety,the results ofmodified TRAP assays predicted that the telomerase activity was inhibited.And the results ofwestern blot showed that the protein expression level of hTERT decreased obviously.ConclusionNovel compound containing dihydropyrazolemoiety inhibits the proliferation of SMMC-7721 andmakes them arrested at S phase.This initial discovery ismainly achieved through the inhibition of telomerase activity by targeting hTERT.
dihydropyrazole;coumarin;human hepatoma cell line SMMC-7721;proliferation inhibition;hTERT
R 962
A
1000-1492(2015)08-1053-05
2015-04-14接收
安徽省科技攻关计划项目(编号:1301042212)
1安徽医科大学药学院,2安徽医科大学肝病研究所,3安徽省高校产业共性技术研究院,合肥 230032
何 旭,女,硕士研究生;
李 俊,男,博士,教授,博士生导师,责任作者,E-mail:lj@ahmu.edu.cn