植物香豆素生物合成途径及关键酶基因的研究现状

江舟

（云南中医药大学，云南昆明 650500）

香豆素类化合物是具有芳香气味的天然产物，通过植物酪氨酸衍生出苯丙烷内酯，从细菌次生代谢产物中鉴定出多种香豆素。目前，在豆科等74 科植物中发现香豆素类化合物，自然界发现香豆素具有抗病毒保护心脏等药理作用，影响多种植物的生长发育，具有调节根系微生物群落结构等作用。根据化合物母核结构分为简单香豆素、异香豆素类等，在自然界中主要分布于菊科、瑞香科等植物中，香豆素类化合物具有光学活性用作荧光增白剂等，合成新型香豆素化合物应用前景广阔，香豆素生物合成主要细节处于探索阶段，本文综述香豆素植物体内相关功能，介绍关键酶基因研究进展，为后续研究提供理论参考。

1 香豆素类化合物简介

1.1 香豆素类型

香豆素是重要的有机杂环化合物，其衍生物具有多种生理学性质，如抗凝血作用等，某些香豆素衍生物具有抗HIV 活性，有些在临床上作为口服抗凝血药广泛应用。香豆素分子存在C=C 双键及内酯结构，具有优异的光学性能，使其呈现荧光量子收率高等特点，是荧光传感器分子设计中的优秀候选荧光团，在医化生等领域广泛应用。香豆素具有芬芳气味，可在饮料食品中作为芳香剂[1]。

天然香豆素类化合物主要存在于瑞香科、芸香科等高等植物中。目前发现天然香豆素类化合物有近千种，可分为简单香豆素，吡喃香豆素等类型。简单香豆素是在苯环上具有取代基香豆素，苯环上的C-6 位电负荷性较高，含氧取代基多出现在C-6 位上。呋喃香豆素类结构中呋喃环是6 位异戊烯基于7 位羟基环合成，根据呋喃环与母体骈合位置分为线性与角型，常见线型有补骨脂素等[2]。吡喃香豆素是6 位异戊烯形成2，2-二甲基-a-吡喃环结构化合物，常见线型吡喃香豆素有独活中的花椒内酯，角型吡喃香豆素有白花前胡中的邪蒿内酯。

1.2 香豆素化合物的功能

香豆素是最简单的植物次生代谢物，细胞受损后释放，香豆素化合物具有抗病毒、抗HIV 等多种药理作用[3]。香豆素主要功能包括参与植物生长过程，香豆素可通过抑制水稻脱落酸分解代谢延迟种子萌发，可抑制超氧化合物歧化酶活性，破坏小麦糊粉层氧化还原稳态，可能在基因转录中起诱导因子作用，香豆素对许多杂草种子萌发具有较强抑制作用。

研究发现，东莨菪内酯具有清除活性氧自由基的作用，在拟南芥中刺激细胞结构发育，植物在缺铁下根系分泌东莨菪内酯等小分子氧化还原活性分子，儿茶酚香豆素可与土壤中铁形成螯合物[4]。东莨菪内酯被分泌到根际抑制植物病原体生长，Beyer 等发现拟南芥东莨菪内酯可抑制锈病真菌活性避免大豆感染，抗菌素东莨菪内酯在烟草根中积累抵御坏死真菌个安然，植物可利用香豆素等代谢物混合物消灭致病菌。香豆酸以无香气糖苷形式存在于液泡中，水解同时闭环生成香豆素，豆科草木犀植株高大，香豆素含量高，香豆素衍生物4-羟基香豆素形成于微生物代谢，霉菌将反式邻香豆酸转化为4-羟基香豆素，双香豆素会引起牲畜内出血导致死亡。

1.3 香豆酸的药理作用

香豆素化合物具有抗寄生虫等多种药理作用。肿瘤是当今危及人类生命的常见疾病，我国肿瘤在首要疾病中排名第二。自然界为人类提供治疗疾病的系列药物，许多化学药物发现源于天然产物，中国传统中医药有大量使用中草药抗肿瘤案例。日本学者对Prangos 体外实验表明，胃腺癌细胞MK-1 细胞具有抑制作用。AIDS 是人类HIV 引起全身性免疫缺陷疾病，目前以HIV 逆转录酶等为靶点，用于临床治疗药物对人体细胞毒性大，可开发天然化合物为先导化合物进行药物研究。

香豆素具有良好的抗菌活性，蛇床子水提物可抑制金黄色葡萄球菌与耐药金黄色葡萄球菌，复方蛇床子水剂可减弱其残余株致病力。天然香豆素在自然界中含量低，人们通过研究香豆素抗菌构效关系将多种结构片段形成复合结构。研究表明，丙沙星取代基引入香豆素3-位得到双取代环丙沙星香豆素衍生物，性能优于环丙沙星，提高单取代环丙沙星香豆素衍生物。1956 年国外学者提出衰老与自由基学说，活性氧与许多衰老相关疾病发生防治有关。川牛膝成分香豆素具有抗肾功能衰竭功能，通过防止生成氧自由基改善肾功能衰竭。瑞香素是临床治疗血栓闭塞型脉管的中草药单体，具有抗红细胞脂质过氧化作用。

2 香豆素化合物的合成

1820 年香豆素首次由慕尼黑香豆中分离，法国尼古拉斯分离出香豆素进行命名。1868 年英国化学家威廉[5]首次合成。生物合成中简单香豆素结构转化是在6位烷基化，取代7 位羟基形成呋喃环香豆素。植物中的L-苯丙氨酸解氨酶可将L-苯丙氨酸转化为反式肉桂酸，在肉桂酸4-羟化酶作用下发生邻羟基化反应，经过反应形成香豆素类化合物等次生代谢产物，叶绿体中缺乏C4H 时C2H 可将肉桂酸转化为邻香豆酸。

2.1 香豆素合成途径研究

香豆素化合物是很多植物次生代谢产物，目前鉴定香豆素物质有数千种，香豆素在农业生产中具有重要作用。有关香豆素合成研究包括香豆素与植物抗病性，香豆素化合物与植物生长关系研究等。植物生长中香豆素起到调控作用，东莨菪烃是香豆素化合物中生物生长抑制剂，香豆素类化合物生长中具有抗氧化剂。香豆素合成途径是苯丙烷代谢中合成植保素支路，具有许多重要生物学功能，抵御多种植物病原菌在植物体内生长繁殖。

酚类植保素是植物体内苯丙烷代谢中一次生物质，主要合成途径为苯丙烷代谢中苯丙氨酸支路，苯丙氨酸解氨酶是关键酶。PAL是苯丙烷代谢途径第一酶，是目前研究最多的酶。国内外对烟草等植物PAL 基因进行克隆分析，目前PAL 在植物抗病中研究广泛。C4H 为首个鉴定植物P450 单加氧酶，代谢途径中作用是催化反式肉桂酸转化为对羟基香豆酸。目前在黄瓜等50 多种植物中克隆C4H 基因，C4H 基因表达受到多种因素调控，研究认为基因启动子序列中存在共同的顺式作用元件。4CL 以C4H 酶催化产物羟基香豆酸为底物，是酚类物质合成的关键点，目前在大豆等植物中发现得到4CL基因。烟草中4CL 由Nt4cl1 参与酚类物质的合成，对4CL 基因研究主要集中于与木本素的关系。

2.2 香豆素合成方法

目前，合成香豆素类化合物方法包括Pechman 法，Perkin 法等。Knoevenagel 法反应原理是在弱碱催化下化合物与醛发生缩合反应生成香豆素衍生物。William[6]首次人工合成Perkin 反应，在强碱弱酸催化下发生烯醇化酸酐缩合反应。Hanson[7]首次报道Pechmann 缩合反应，含活泼氢酮酸脂与取代苯酚发生亲电取代反应，与酚羟发生内酯交换。最近对Pechmann 反应研究增多。

Perkin 法最早用于制备香豆素类化合物合成法，是工业生产香豆素主要方法，存在羟醛缩合等副反应。Kneovenagel 合成法与Perkin 类似，适合制备3 位取代香豆素类化合物。Pechmann 合成法因催化剂酸用量较大，副产物较多，分离提取困难。改进方法使香豆素化合物合成效率得到提高，成为当今研究热点。香豆素生物合成包括反式肉桂形成香豆素与其他羟基化香豆素，与UDP-葡萄糖在2-香豆酸O-B 葡萄糖基转移酶下生成反式邻香豆酸β-葡萄糖苷，在紫外线辐射下引起非酶光化学反应。香豆素非游离态以葡萄糖苷形式存在，自发内酯化形成游离香豆素。

反式肉桂酸在C4H 作用下进行对羟基化形成对香豆酸，与对香豆酰CoA2-羟化酶生成2-二羟基香豆素酰CoA。香豆酸可与香豆酸-羟基化酶作用生成咖啡酸，对香豆酰Co 可在羟基肉桂酰基肉桂酰基转移酶作用下生成对香豆酰莽草酸，咖啡CoA 与咖啡酰辅酶下生成阿魏酰CoA，在香豆素酶作用下发生内酯化形成东莨菪内酯。咖啡酰CoA 可在体外与含酚酶活性植物提取物作用转化成七叶亭，伞形花内酯6-羟基化在P450单加氧酶作用下完成。七叶亭合成通过对香豆素酸到2-二羟基肉桂酸实现。

3 香豆素生物合成关键酶基因

研究对香豆素含量存在差异百花草木樨进行转录组测序分析，鉴定出213 个unigenes 为苯丙氨酸合成途径，初步归纳百花草木樨香豆素合成通路。Wu[8]等对不同香豆素含量百花草木樨调控香豆素合成基因micro RNA 分析，利用GO 对预测靶基因功能注释，研究者在香豆素合成途径中挖掘多个参与香豆素合成基因。香豆素合成通路中大多基因以家族形式存在于植物中，PAL为限速酶调节进入苯丙烷代谢总通量，发现At PAL1 控制类黄酮合成，ClassI 与木质素合成相关。

Vogt[9]认为CCo AOMT 与木质素合成相关，拟南芥根中东莨菪内酯产生需要C3H 活性，东莨菪内酯含量下降3%。Kawai[10]等将2OGDs 分为DOXB 与DOXC，芸香Rg C2'H 仅催化p-香豆酰CoA 形成伞形花内酯。拟南芥At F6'H1 介导阿魏CoA 邻羟基化生成东莨菪内酯。AtF6'H2 仅为具有对肉桂酸CoA 硫代脂活性，S8H与同源基因F6'H2 转化本氏烟草叶片，由于烟草叶片中自然存在阿魏酸，F6'H2 过量表达为S8 催化反应提供底物。Vanholme[11]等在拟南芥中发现COSY，COSY 是BAHD-酰基转移酶家族成员，C2'H 作用下随后顺反应异构化是光催化，研究表明，COSY 在闭光器官中的香豆素合成具有重要功能。催化碳水化合物部分β-葡萄糖苷键水解产生香豆素苷元形式。BGLU 广泛参与细胞壁木质化等植物次生代谢重要生理过程，拟南芥中At BGLU21-23 控制产生东莨菪苷水解，AtBGLU42 参与诱导机体对细胞疾病的抵抗力。UGT 为糖基转移酶I 家族，植物可通过UGT 将东莨菪内酯转化为东莨菪苷，糖基化香豆素将东莨菪苷转化为东莨菪内酯。

4 模式植物中UGT 基因家族系统进化分析

UDP-葡萄糖基转移酶基因家族在香豆素代谢中起到重要作用，糖基化在调节次生代谢产物有效性方面起到重要作用，可以改变在细胞内的运动，糖基化是糖基转移酶催化常见后修饰过程。UGT 基因家族C 末端含有44 个氨基酸组成保守序列PSPG 基序，仅凭序列信息无法可靠预测物种间糖基化次生代谢产物结构变化。UG 分布广泛，单双子叶植物在物种间所占基因数量差异小，研究对拟南芥121 个，蒺藜苜蓿243 个UGT氨基酸序列多序列对比，构建系统进化树bootstrap 为1000。拟南芥14 组，痢疾苜蓿15 个组，F 组为双子叶植物特有组，在DE 组中UGT 数量最多。D 组中蒺藜苜蓿比其他植物扩张明显，IG 组水稻和蒺藜苜蓿中有明显扩张。大豆组中GmSGT2 参与大豆皂苷I 的生成物合成，拟南芥D 组参与类黄酮等生物合成。G 组参与萜类化合物黄橙橙。预测DE 组可能与香豆酸合成相关。

5 结语

综述了香豆素生物合成途径关键酶基因研究进展，大量研究对生物合成途径诸多基因进行克隆鉴定，更多研究针对单个基因功能研究。关键基因是单一参与香豆素生物合成。结构基因在香豆素生物合成途径调控网络模糊，具体调控靶基因作用机制不明确。香豆素含量高的植物遗传转化体系不成熟。今后香豆素生物合成研究应关注利用转录组学等现代生物技术发掘香豆素生物合成关键酶基因，在香豆素生物合成下游途径探索；克隆出调控香豆素合成基因后，构建非模式植物转基因体系进行功能验证，从遗传学角度研究验证香豆素合成不同基因生物学功能。