Propachlor对前列腺癌细胞PC3及LNCaP的作用及其可能机制

邰 胜，徐凌凡，徐 明，张阳阳，张 力，梁朝朝

◇基础医学研究◇

Propachlor对前列腺癌细胞PC3及LNCaP的作用及其可能机制

邰 胜1，2，徐凌凡1，徐 明1，张阳阳1，张 力1，2，梁朝朝1，2

目的探讨化合物Propachlor对前列腺癌的作用及可能的分子机制。方法用梯度浓度的化合物Propachlor处理前列腺癌PC3及LNCaP细胞株；使用CellTiter方法检测肿瘤细胞的存活率，Western blot法检测细胞自噬蛋白LC3-Ⅱ的转变情况，荧光显微镜检测细胞中诱导LC3质粒标记绿色荧光蛋白（GFP-LC3）的表达情况。结果Propachlor可以抑制前列腺癌PC3及LNCaP细胞的存活率，同时剂量越大肿瘤细胞存活率抑制越明显；Propachlor可以诱导PC3及LNCaP肿瘤细胞自噬蛋白LC3-Ⅱ及自噬小体GFP-LC3的表达，诱导自噬效应同Propachlor的剂量正相关。结论化合物Propachlor具有抗前列腺癌的生物学效应，同时该抗肿瘤效应是通过激活细胞内自噬效应产生的。

前列腺癌；Propachlor；自噬

前列腺癌是老年男性一种常见的泌尿外科疾病，近年来在我国前列腺癌的发病率呈上升趋势。同时有相当一部分前列腺癌发现时已经为晚期，对现有的外科及内分泌治疗效果均不佳；因此，研究开发出新的晚期前列腺癌治疗方法十分必要［1］。通过高通量筛查的方法，发现一种新的化合物Propachlor，具有抗前列腺癌的生物学效应，分子式见图1。自噬是细胞体内一种自身蛋白质的降解过程，相关的研究［2］表明诱导肿瘤细胞体内的自噬效应具有抗肿瘤的生物学效应。该研究使用化合物Propachlor处理前列腺癌PC3及LNCaP细胞，观察化合物Propachlor是否通过激活细胞内自噬效应起到抗前列腺癌的生物学效应，为前列腺癌的治疗提供新的思路与策略。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料前列腺癌LNCaP细胞购自美国ATCC公司；前列腺癌PC3细胞由美国加州大学洛杉矶分校Jiaoti Huang教授提供［3］；化合物Propachlor购自美国Sigma公司；CellTiter购自美国Promega公司；LC3质粒标记绿色荧光蛋白（green-fluorescent-LC3，GFP-LC3）转染质粒、Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；兔抗LC3多克隆抗体购自美国GenScript公司；鼠抗β-actin抗体、ECL试剂盒及细胞培养试剂均购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞存活率及生长曲线 前列腺癌PC3及LNCaP细胞分别在含有5%胎牛血清的DMEM及RPMI培养基，37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，后使用梯度浓度剂量的化合物Propachlor（0、2.5、5、10μmol／L）处理LNCaP及PC3细胞株24 h，使用CellTiter试剂盒裂解细胞测定细胞ATP，检测细胞的相对存活率。后再次使用梯度浓度剂量的化合物Propachlor（0、2.5、5、10μmol／L）处理LNCaP及PC3细胞株1、2、3、4 d，使用CellTiter的方法测定肿瘤细胞的生长曲线。

1.2.2 Western blot检测化合物Propachlor处理后肿瘤细胞LC3表达 分别使用梯度浓度剂量的化合物Propachlor（0、2.5、5、10μmol／L）处理培养后的LNCaP及PC3细胞株24 h，使用细胞裂解液（20 mol／L KCl，150 mol／L NaCl，1%NP-40，50 mol／L NaF，50 mol／L TrisHCl，pH＝7.5，1 mol／L DTT，1 mol／L EGTA，1×Protease Inhibitor，10%Glycerol）在冰上裂解细胞5 min，4℃、1 500 r／min离心15min，使用Bradford Assay试剂盒对裂解液上清液中蛋白质浓度进行相关测定。等量蛋白的裂解液上样在15%SDS-PAGE凝胶，电泳后将蛋白转移至PVDF膜上；使用脱脂牛奶对PVDF膜封闭1 h，LC3一抗将封闭的PVDF膜进行孵育过夜，PBS洗涤30 min，二抗孵育30 min，PBS洗涤约30 min，采用ECL试剂盒检测LC3蛋白质的表达。

1.2.3 免疫荧光检测细胞中自噬小体的表达 肿瘤细胞使用Lipofectamine 2000质粒转染试剂转染，24 h后更换培养基。分别使用梯度浓度剂量的化合物Propachlor（0、2.5、5、10μmol／L）处理转染后的LNCaP及PC3细胞株24 h。使用4%多聚甲醛固定细胞约30 min，用PBS洗涤细胞2次，再用DAPI染色15min，荧光显微镜下观察自噬小体的表达情况。

1.3 统计学处理采用SPSS 13.0统计软件进行分析，组间比较采用独立样本t检验。

2 结果

2.1 化合物Propachlor抑制前列腺癌细胞生长

使用梯度浓度剂量的化合物Propachlor（0、2.5、5、10 μmol／L）处理培养后的前列腺癌LNCaP及PC3细胞株24 h，发现随着Propachlor浓度的增大肿瘤癌细胞的存活率被抑制的越多，差异有统计学意义（P＜0.05）；使用梯度浓度剂量化合物处理前列腺癌PC3及LNCaP细胞1、2、3、4 d后，肿瘤细胞的生长曲线进一步表明化合物Propachlor可以明显抑制肿瘤细胞的生长，且随着Propachlor剂量的增加，肿瘤细胞的生长抑制越显著，见图2。

2.2 化合物Propachlor可以诱导肿瘤细胞自噬蛋白LC3的表达随着浓度的增加肿瘤细胞中LC3-Ⅰ型分子向LC3-Ⅱ型分子转变的趋势越明显，表明化合物Propachlor可以诱导前列腺肿瘤细胞PC3、LNCaP的自噬效应，同时随着Propachlor剂量的增加诱导自噬的效应越明显，见图3。

2.3 化合物Propachlor可以诱导肿瘤细胞自噬小体GFP-LC3 dots的表达是自噬小体的一种结构，在荧光显微镜下一般分布在细胞膜周围呈戒指环样结构，也可呈多聚点状分布。当前列腺癌细胞PC3及LNCaP接受化合物Propachlor处理后可以诱导GFP-LC3的表达；同时随着Propachlor浓度的增加，诱导表达的GFP-LC3分子越多，表明高剂量的化合物浓度可以诱导较强的自噬效应，见图4。

3 讨论

前列腺癌是欧美男性一种常见的恶性肿瘤，近年来发病率在我国呈上升趋势［1］。其中有一部分前列腺癌患者发现时已为晚期前列腺癌，已经失去手术时机；同时绝大多数前列腺癌患者对目前的内分泌治疗及新型分子药物的治疗均会出现不同程度的耐受，最终会转变为激素抵抗性前列腺癌（castra-tion resistant prostate cancer，CRPC）［2，4－7］。因此，十分有必要发现新型的化合物去治疗前列腺癌，尤其是晚期前列腺癌CRPC。

通过高通量筛查的实验方法发现一种新的化合物Propachlor具有较强的抗前列腺癌的生物学效应，可以明显抑制前列腺癌细胞PC3、LNCaP的存活率；对肿瘤细胞的生长曲线也可以明显抑制。进一步研究表明Propachlor对前列腺癌细胞生长的抑制是通过诱导了肿瘤细胞体内的自噬效应完成的。自噬发生过程主要是吞噬需要降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，并与内涵体形成所谓的自噬内涵体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新［6－7］。同时细胞体内的自噬效应同细胞内磷脂酰肌醇激酶－蛋白激酶A-雷帕霉素（PI3K-AKt-mTOR）下游等多条信号转导通路的调节有着密切的相关性；有研究表明诱导自噬可以起到抗肿瘤的作用，亦有相关的研究表明抑制自噬也可以起到抑制肿瘤的生物学效应；认为自噬是在肿瘤细胞生长的调控中起到双刃剑的作用［8－14］。目前，已有研究［6］表明多种化合物均具有不同程度诱导、抑制细胞自噬的作用。蛋白LC3为自噬小体形成过程中一种重要的蛋白分子，其生物学形式具有LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ两种形式，LC3-Ⅱ型蛋白具有较强的生物学活性；目前普遍认为在自噬的形成过程中普遍存在着LC3-Ⅰ型分子向LC3-Ⅱ型分子的转变，因此LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ分子之间的比例与细胞体内自噬诱导的程度呈正相关性。

使用梯度浓度剂量的化合物Propachlor（0、2.5、5、10μmol／L）处理培养后的前列腺癌LNCaP及PC3细胞株24 h，在PC3及LNCaP细胞中均发现LC3-Ⅰ型蛋白向LC3-Ⅱ型蛋白的转变，同时随着化合物剂量的增加，LC3-Ⅰ型向LC3-Ⅱ转变的趋势越明显，表明化合物Propachlor可以诱导自噬效应，自噬的诱导同化合物的浓度剂量呈正相关性。化合物均存在着相关的细胞毒性效应并且细胞毒性效应与其剂量呈正相关性，因此对化合物Propachlor诱导肿瘤细胞自噬的生物学效应仍应进一步评价其对细胞的细胞毒性效应。当细胞体内诱导自噬后自噬体形成最终会和溶酶体相结合形成自噬溶酶体，自噬溶酶体可聚集形成点状结构；带有GFP标记的LC3蛋白分子在荧光显微镜下即可表现出点状结构［8］，进一步从形态学角度证明化合物Propachlor可以诱导前列腺癌PC3及LNCaP细胞的自噬效应，同时诱导的自噬效应同化合物的浓度呈正相关性。前列腺癌为前列腺恶性肿瘤中最为常见的一种病理学类型，LNCaP细胞为一种腺癌细胞可以代表临床上绝大多数前列腺恶性肿瘤的生物学性状；因此可以进一步使用肿瘤患者的前列腺癌细胞株去检测化合物Propachlor抗前列腺癌生物学效应及诱导自噬情况；临床上有相当一部分前列腺癌为CRPC及对晚期的内分泌治疗均不佳，有相关研究［3］表明前列腺癌PC3细胞具备前列腺小细胞癌的生物学特性，因此化合物Propachlor对前列腺小细胞癌也可存在通过诱导自噬抗肿瘤生长的生物学效应。可以进一步建立前列腺癌小鼠动物模型，在前列腺癌患者的细胞中检测化合物Propachlor抗肿瘤及诱导自噬的生物学效应，为前列腺癌的治疗提供新的策略与新思路。

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The function and possiblemechanism of Propachlor on anti-prostate cancer LNCaP and PC3 cells

Tai Sheng1，2，Xu Lingfan1，Xu Ming1，et al
（1Dept of Urology，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022；2The Urological Institute of AnhuiMedical University，Hefei 230032）

Objective To explore themechanism of Propachlor anti-prostate cancer.MethodsThe LNCaP and PC3 cellswere treated with Propachlorwith the gradient concentration.The CellTiterwas performed to test the cell variability，and the western blotwas also performed to detect the LC3-Ⅱconversion.The GFP-LC3 was observed under the fluorescencemicroscope.ResultsThe PC3 and LNCaP cells variability was inhibited with the Propachlor，and little cell variability was linked with high concentration Propachlor.The Propachlor might induce the PC3 and LNCaP cells autophagy with LC3-Ⅱconversion and GFP-LC3 dots increase，which was also linked with high concentration Propachlor.ConclusionThe compound Propachlormay be anti-prostate cancer via induction of autophagy among prostate cancer cells.

prostate cancer；Propachlor；autophagy

R 737.25

A

1000－1492（2015）08－1045－04

2015－04－22接收

安徽省自然科学基金（编号：1308085QH132）；国家自然科学基金青年科学基金培养计划（编号：2012KJ13）；国家临床重点专科建设项目基金（编号：2100299）；院内博士科研基金（编号：20120119）

1安徽医科大学第一附属医院泌尿外科，合肥 230022

2安徽医科大学泌尿外科研究所，合肥 230032

邰 胜，男，医师，博士；

梁朝朝，男，主任医师，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：Liang＿chaozhao＠163.com