长链非编码RNA HOTAIR对肾癌细胞增殖和凋亡的影响

夏 明，黄卫人，蔡志明

长链非编码RNA HOTAIR对肾癌细胞增殖和凋亡的影响

夏 明1，2，黄卫人2，蔡志明1，2

目的探讨长链非编码RNA（LncRNA）HOTAIR对肾癌细胞系786-O和ACHN增殖和凋亡的影响。方法两种细胞系转染针对HOTAIR的小干扰RNA（siRNA），利用qRT-PCR检测干扰效率，再分别以噻唑蓝（MTT）法、ELISA法和Hochest染色法检测HOTAIR表达降低后786-O和ACHN细胞在增殖和凋亡方面的变化。结果siRNA可有效降低HOTAIR表达（P＜0.05）；减少HOTAIR含量可显著抑制两种细胞的增殖（P＜0.05），同时增加细胞凋亡（P＜0.05）。结论HOTAIR具有促进肾癌细胞生长的作用。

肾癌；长链非编码RNA；HOTAIR；细胞增殖；细胞凋亡

肾癌是一种常见泌尿系统肿瘤，占成人肿瘤发病率3%［1］，且近年来发病率增长幅度最高。目前，早中期肾癌主要利用手术治疗［2］，但仍有1／3肾癌患者属于晚期，对放、化疗不敏感［3］。因此，深入探索肾癌发生的详细分子机制将对肾癌早期诊断及中晚期治疗具有重要益处。

长链非编码RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是一类转录本大小长于200个核苷酸的不翻译RNA，在人类基因组中，保守估计大约有23 000个LncRNA［4］。LncRNA可在多个水平如转录、转录后及表观遗传等调控基因表达，参与物种进化、细胞分化、器官形成、胚胎发育、物质代谢等基础生命活动，并参与恶性肿瘤等多种疾病发生［5］。HOTAIR（hox transcriptantisense intergenic RNA）是一种研究较多的LncRNA，其异常表达与乳腺癌、肝癌、食管癌和肺癌等多种肿瘤相关，提示其是一种重要的癌症发生相关因子［6－9］。该研究旨在体外观察HOTAIR对肾癌细胞生长的影响，如细胞增殖、凋亡的变化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人肾癌细胞系786-O和ACHN均购自中国科学院上海生命科学院细胞库。

1.1.2 试剂 Lipofectamine 2000、TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）、DMEM培养基、谷氨酰氨、青霉素－链霉素混合液胎牛血清（FBS）（美国Gibco公司）、四甲基偶氮唑盐（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）（美国Sigma aldrich公司）、人胱天蛋白酶3（Caspase-3）ELISA检测试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）；人HOTAIR-siRNA（5’-UUAAGUCUAGGAAUCAGCACGAAGC-3’）、阴性对照（5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’）（上海吉玛公司）。

1.1.3 主要仪器 高速冷冻离心机（美国Sigma公司）、NanoDrop2000超微量分光光度计（美国Thermo Scientific公司）、Thermal Cycler C1000 PCR仪（美国BIO-RAD公司）、Light Cycler 480II实时荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司）、THZD型台式恒温振荡器（江苏省太仓市实验设备厂）、DTX880荧光检测仪（美国Beckman Coulter公司）。

1.2 细胞培养人肾癌细胞786-O、ACHN培养于含10%FBS、1%谷氨酰胺、1%青霉素－链霉素混合液的DMEM培养基中，置37℃、5%CO2培养箱培养，隔天换液，常规消化、传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 细胞转染取对数生长期细胞接种于6孔、96孔或24孔细胞培养板中，待细胞贴壁且融合度达到40%～60%时，将HOTAIR-siRNA、阴性对照序列（NC）分别由Lipofectamine 2000转染入细胞，置37℃孵育6 h，随后弃转染液，换10%FBS的正常DMEM培养基继续培养。

1.4 qRT-PCR检测HOTAIR表达量收集转染后48 h细胞，按TRIzol试剂说明书提取总RNA。根据逆转录及qRT-PCR试剂盒说明设置反应条件及

2015－04－29接收

基金项目：国家重点基础研究发展计划（973计划）（编号：2014CB745200）；国家自然科学基金（编号：81272840）；国家自然科学青年基金（编号：81201579）

作者单位：1安徽医科大学附属深圳市第二人民医院临床学院，深圳518035

2深圳市第二人民医院泌尿生殖系统肿瘤研究重点实验室和医学重编程技术重点实验室，深圳 518035

作者简介：夏 明，男，硕士研究生；

蔡志明，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：caizhiming2000＠163.com

参数，以GAPDH为内参，进行逆转录合成cDNA及qRT-PCR扩增。引物序列均由华大基因合成，HOTAIR上游引物：5’-GGGTGGCTCACTCTTCTGGC-3’，下游引物：5’-TGGCCTTGCCCGGGCTTGTC-3’；GAPDH上游引物：5’-CGCTCTCTGCT CCTCCTGTTC-3’，下游引物：5’-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3’。采用2

－ΔΔCt

法进行分析，ΔCt＝Ct

HOTAIR

Ct

GAPDH

，ΔΔCt＝（Ct

HOTAIR

-Ct

GAPDH

）干扰组－（Ct

HOTAIR

Ct

GAPDH

）对照组。

1.5 MTT法检测细胞增殖取对数生长期细胞接种于96孔细胞培养板，24 h后转染，设置两组，阴性对照组（NC组）和HOTAIR转染组，每组设置5个复孔，分别于转染后24、48、72 h进行MTT检测。实验终止前4 h加入MTT溶液10μl／孔，继续培养4 h后弃培养液，加入DMSO 150μl／孔，震荡10 min后，在酶标仪波长490 nm处检测各孔光密度（optical density，OD）值。计算并统计生长抑制率（growth inhibitory rate，GIR，%）＝1－（ODHOTAIR／ODNC）× 100%。

1.6 ELISA法检测细胞凋亡在24孔板中接种对数生长期细胞，24 h后按对照组及干扰组进行转染，每组设6个复孔，转染48 h后消化收集细胞，用PBS重悬后反复冻融致细胞裂解。将细胞裂解液加入已经包被Caspase-3抗体的聚苯乙烯板的反应孔中，37℃孵育30 min，弃液后洗板3次，再加入辣根过氧化物酶标记工作液，37℃孵育30 min，弃液再洗板5次后加入底物溶液，避光显色20 min，最后加入终止液。反应终止后5 min内用酶标仪在450 nm波长下测量每孔OD值，OD值大小可以间接反映Caspase-3的酶活性，进而说明细胞凋亡程度。

1.7 Hoechst33342染色检测细胞凋亡将对数生长期细胞接种于12孔板（内含细胞爬片），24 h后转染，转染48 h后取出PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，去固定液，再用PBS洗1～2次，加入Hoechst33342染色液，染色5～15 min，再用PBS洗2次，将爬片取出，反盖在滴有抗荧光淬灭封片液的载玻片上，稍晾干后荧光显微镜下观察拍照，再统计被致密蓝染的凋亡细胞。

1.8 统计学处理采用SPSS 19.0统计软件分析，上述实验均重复3次，实验数据以±s表示，组间差异比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。图表用GraphPad Prism 5.0生成。

2 结果

2.1 siRNA可显著降低细胞内HOTAIR表达在肾癌细胞株786-O与ACHN内，与对照组相比，干扰组细胞内HOTAIR表达均降低，分别为对照组的25.13%及40.84%，差异均有统计学意义（t＝6.05、5.94，P＜0.05），见图1。表明转染HOTAIR siRNA可成功下调786-O及ACHN细胞内HOTAIR的表达。

2.2 下调HOTAIR表达可抑制786-O和ACHN细胞增殖MTT法结果显示，HOTAIR siRNA转染786-O细胞后24、48、72 h较对应时间对照组OD值明显降低（t24h＝4.294，t48h＝88.00，t72h＝15.68；P＜0.05）。抑制率最高可达（28.16±1.18）%。见图2A。HOTAIR siRNA干扰ACHN细胞后24、48、72 h较对应时间点对照组OD值明显降低（t24h＝83.66，t48h＝24.58，t72h＝24.48；P＜0.05），抑制率最高可达（35.27±5.95）%。见图2B。

2.3 下调HOTAIR表达可增加786-O和ACHN的细胞凋亡在肾癌细胞786-O及ACHN中，siRNA干扰组的Caspase-3相对活性分别为对照组的1.49倍（t＝6.309，P＜0.01）及1.50倍（t＝9.075，P＜0.05）。见图3。

Hoechst染色法检测显示，上述两个细胞系中，HOTAIR siRNA干扰组相比于对照组的凋亡细胞均显著增多，见图4。统计后，786-O细胞系干扰组凋亡率是对照组的1.67倍（t＝19.42，P＜0.05），而ACHN细胞系内干扰组凋亡率是对照组的2.49倍（t＝19.15，P＜0.01），见图5。

3 讨论

HOTAIR是第一个被发现具有反式转录调控作用的LncRNA，仅存在于哺乳动物。人的HOTAIR全长2158碱基，基因定位于染色体12q13.13的HOXC11与HOXC12之间，包括6个外显子［10］。研究［6－9］表明HOTAIR对乳腺癌、肝癌、食管癌、肺癌等癌细胞体外增殖和凋亡有重要影响，尚未有肾癌方面的报道。已有研究［11］显示HOTAIR在多个肾癌细胞系中存在高表达，由此推断，HOTAIR也可能对肾癌细胞生长有重要影响。

本研究结果显示HOTAIR表达下调可显著抑制细胞增殖，同时增加细胞凋亡，从而意味着HOTAIR是一种重要的肾癌细胞生长正调控因子，扮演着“癌基因”的角色，这与HOTAIR在其他肿瘤中的作用相一致。因此，深入研究HOTAIR促进肾癌细胞生长机制对理解肾癌发生、发展以及转移具有非常重要的意义。

前期研究［12］表明，HOTAIR可结合哺乳动物多梳蛋白抑制复合体2（polycomb repressive complex2，PRC2）和组蛋白去甲基化酶复合体（LSD1／REST）并发挥脚手架作用，即其5’端和PRC2结合，而其3’端和LSD1复合物结合。PRC2由甲基转移酶EZH2、SUZ12和EED三亚基组成，其中起主要作用的EZH2亚基可催化组蛋白H3第27位赖氨酸（histone H3 lysine K27，H3K27）甲基化，生成H3K27me3（转录抑制标志），进而招募PRC2至特定位点沉默HOXD基因座及相关抑制基因如HOXD10、JAM2、PCDH10等转录，从而导致恶性肿瘤的转移或复发［13］。前期研究［14］还表明在EZH2与HOTAIR结合区域和EZH2与BRCA1结合区域存在重叠，因此HOTAIR可竞争性抑制BRC1与EZH2的结合，这种竞争性结合在染色质水平上调节PRC2依赖性的基因转录。此外，HOTAIR与EZH2的结合还依赖于EZH2的磷酸化修饰［15］。EZH2的苏氨酸残基345（T345）和487（T487）可被细胞周期依赖性蛋白激酶CDK1和CDK2磷酸化，而EZH2-T345磷酸化可增强HOTAIR与EZH2的亲和力，该位点的突变可破坏HOTAIR与EZH2的相互作用。总之，HOTAIR主要通过影响特定基因位点H3K27甲基化状态而影响基因表达，最终促进肿瘤细胞的增殖、抑制细胞凋亡。本实验亦初步显示下调HOTAIR表达，肾癌细胞ACHN和786-O中HOXD10基因启动子上游H3K27me3含量显著降低，但尚需进一步验证（数据未提供）。

综上所述，本实验确定了LncRNA HOTAIR对肾癌细胞增殖的正调控作用，为肾癌的诊断和治疗提供了新的候选分子，为进一步研究分子机制奠定了基础。

（致谢：此文章获得深圳市医疗卫生“三名工程”资助）

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Effect of long non-coding RNA HOTAIR on the proliferation and apoptosis of renal cancer cells

Xia Ming1，2，HuangWeiren2，Cai Zhiming1，2
（1Shenzhen Second Hospital Clinical School of Anhui Medical University，Shenzhen 518035，2Shenzhen Key Laboratory of Genitourinary Tumor and Key Laboratory of Medical Reprogramming Technology，Shenzhen Second People’s Hospital，Shenzhen）

Objective To investigate the effect of long non-coding RNA（LncRNA）Hox transcript antisense intergenic RNA（HOTAIR）on the cell proliferation and apoptosis of renal cancer cell lines 786-O and ACHN. Methods Small interfere RNA（siRNA）thataims to down-regulate HOTAIR expression was transfected into tworenal cell lines respectively，and the transfection efficiency was evaluated by qRT-PCR.Then the MTT assay，Hochest staining assay and enzyme-linked immunosorbnent assay（ELISA）were used to detect cell proliferation and apoptosis.ResultsThe expression of HOTAIR could be down-regulated effectively by the siRNA（P＜0.05）. Down-regulation of HOTAIR could inhibit the proliferation（P＜0.05）and increase apoptosis（P＜0.05）of two renal cancer cells.ConclusionHOTAIR plays a role in promoting cell growth of renal cancer.

renal cancer；long non-coding RNA；HOTAIR；cell proliferation；apoptosis

R 737.11

A

1000－1492（2015）08－1095－05