miRNA-34a对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡的影响

邓晓晶，邓 敏，宋育林，王启之

miRNA-34a对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡的影响

邓晓晶1，2，邓 敏2，宋育林1，王启之2

目的研究microRNA-34a（mir-34a）在人胃癌细胞中的表达水平及对胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡的影响。方法通过实时定量PCR（RT-PCR）检测人正常胃黏膜上皮细胞GES及人胃癌细胞株AGS、SGC-7901、MKN-45、BGC-823中mir-34a的表达水平。体外将表达人mir-34a（has-mir-34a）慢病毒感染人胃癌SGC-7901细胞。荧光显微镜观察评估细胞感染情况，MTT实验、流式细胞术检测感染后胃癌SGC-7901细胞的增殖、细胞周期及凋亡情况。结果胃癌细胞AGS、SGC-7901、MKN-45、BGC-823中mir-34a的表达水平较正常胃黏膜上皮细胞GES明显降低，其中以胃癌SGC-7901细胞降低最为明显（P＜0.01）。与阴性对照组相比，mir-34a感染组SGC-7901细胞增殖明显减慢（P＜0.01），G1／G0期细胞比例显著增加（P＜0.05），细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）。结论mir-34a在多种人胃癌细胞，尤其是SGC-7901细胞中呈低表达。mir-34a可以抑制胃癌SGC7901细胞的增殖，诱导细胞周期停滞及细胞凋亡。

胃癌；SGC-7901细胞；微小RNA；microRNA-34a；增殖；凋亡

胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，在世界范围内，胃癌位居癌症发病率第4位，死亡率第2位［1］。胃癌的发生、发展是一个复杂过程，涉及到多种致癌的信号传导通路，其中表观遗传学变化的作用越来越受到重视［2］。微小RNA（microRNA，miRNA）作为一类高度保守的、非编码、小分子调节RNA参与癌症发生、发展的表观遗传调控机制已备受瞩目［3］。研究［4］显示，miRNA的表达水平失调出现在众多恶性肿瘤中，而人类一半以上的miRNA基因位于染色体上肿瘤相关性基因位点，这提示miRNA具有癌基因或抑癌基因的功能。miRNA-34家族（mir-34s）受著名的“基因守护者”p53直接调控［5］，其肿瘤抑制功能在多种恶性肿瘤中（结直肠癌、肺癌、恶性胶质瘤、胰腺癌等）均被证实［6－7］。该研究通过检测多种人胃癌细胞株中mir-34a的表达水平，最终选定胃癌SGC-7901细胞为研究对象，通过稳定转染外源性has-mir-34a进一步研究其对细胞增殖、周期及凋亡的影响，旨在为miRNA作为胃癌分子靶向治疗的可能性提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂人正常胃黏膜上皮细胞株GES、人胃癌细胞株AGS、SGC-7901、MKN-45、BGC-823由上海细胞生物研究所提供；胎牛血清（FBS）、RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司；总RNA提取试剂盒TRIzol购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒M-MLV购自美国Promega公司；SYBR premix ex taq试剂盒购自美国Axygen公司；目的基因及内参基因上下游引物购自广州锐博生物公司；has-mir-34a、阴性对照慢病毒表达载体及质粒由上海吉凯基因公司合成；噻唑蓝（MTT）试剂盒购自北京鼎国生物技术有限责任公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）购自美国Sigma公司；RNase A购自加拿大Fermentas公司；细胞凋亡试剂盒购自美国eBioscience公司。

1.2 细胞培养复苏GES、AGS、SGC-7901、MKN-45、BGC-823细胞，用含10%FBS的RPMI1640培养基，置于37℃5%CO2培养箱培养，2 d换液，将生长90%汇合的细胞进行传代。

1.3 实时定量PCR（RT-PCR）检测各细胞株mir-34a的表达水平收集生长状态良好的细胞，加入1 ml TRIzol试剂、200μl氯仿，离心后取上层液体，加入等体积预冷的异丙醇，离心后弃上清液，以75%乙醇溶液洗涤沉淀，待RNA沉淀基本透明时，加入RNase-free水至充分溶解，Nanodrop 2000分光光度计分析测定抽提总RNA的质量及浓度，应用MMLV试剂盒逆转录合成cDNA。在包含上下游引物、cDNA、2×SYBR premix ex taq等的反应体系中，以U6作为内参，进行RT-PCR扩增。试验独立重复3次，每次设3个复孔。目的基因表达丰度以2－ΔΔCt方法进行相对定量，取复孔平均值进行后续统计学分析。

1.4 has-mir-34a慢病毒表达载体的合成及感染has-mir-34a慢病毒颗粒及阴性对照病毒颗粒由上海吉凯基因公司合成提供。has-mir-34a序列为5’-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3’，阴性对照序列为：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGTCTC-3’。收集处于对数生长期的SGC-7901细胞，病毒感染前1 d将细胞分入6孔培养板培养，按实验设计分组，感染当天于各组分别加入包装完备的慢病毒颗粒进行感染实验。感染3 d后应用荧光显微镜观察各组绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表达情况。本实验分为3组：空白组，即未感染任何病毒组；阴性对照组（NC组），即感染阴性对照病毒组；mir-34a组，即感染has-mir-34a病毒组。

1.5 MTT法检测细胞增殖于慢病毒感染第4天进行。将待测各实验组SGC-7901细胞胰酶消化并计数，以3 000个细胞／孔接种于96孔板中，每组设5个复孔。显微镜观察并调整细胞密度后置于37℃、5%CO2培养箱连续培养5 d。每天于培养终止前4 h加入20μl浓度为0.01 mol／L的MTT于孔中，4 h后完全吸去培养液，加150μl二甲基亚砜（DMSO）溶解甲瓒颗粒，振荡器振荡5～10 min，用酶标仪在490 nm波长处测定其吸光度（optical delnsity，OD）值，即OD490。计算各组细胞每天相对于第1天的增殖倍数（OD490／fold），并以时间为横坐标，OD490／fold为纵坐标绘制细胞增殖曲线图。

1.6 流式细胞术检测细胞周期于慢病毒感染第6天进行。待各实验组SGC-7901细胞于60 mm培养皿中生长至覆盖率80%左右时，评估细胞生长未进入平台期。予以洗涤、消化后收集细胞于5 m l离心管中，每组设3个复孔。4℃预冷的PBS缓冲液洗涤细胞沉淀1次，70%酒精固定细胞至少1 h，PBS再次洗涤细胞沉淀一次。加入细胞染色液PI，充分重悬后上流式细胞仪检测各组SGC-7901细胞周期。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡于慢病毒感染第6天进行。收集各实验组SGC-7901细胞，胰酶消化后，收集细胞于5 m l离心管中，每组设3个复孔。离心后弃上清液，细胞沉淀以PBS洗涤1次，离心后重悬。取细胞悬液加入Annexin V-APC染色，于室温下充分避光10～15 min。上流式细胞仪检测各组SGC-7901细胞凋亡。

1.8 统计学处理采用SPSS 19.0统计软件进行分析，数据以±s表示，两组间比较采用独立样本间t检验，多组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 mir-34a在各细胞株中的表达情况RT-PCR结果显示，mir-34a在人胃癌细胞株AGS、SGC-7901、MKN-45和BGC-823中的相对表达量均分别明显低于其在正常人胃黏膜上皮细胞GES的相对表达量，差异均有统计学意义（t＝17.522、22.879、13.836、14.393，P＜0.05），其中以胃癌细胞SGC-7901的mir-34a相对表达量降低最为明显（P＜0.01）。见图1。

2.2 慢病毒感染效率评估慢病毒感染SGC-7901细胞3d后，荧光显微镜观察GFP表达率已达80%以上，见图2。待细胞长满培养板收集细胞进行后续实验。

2.3 mir-34a对SGC-7901细胞增殖的影响通过MTT法连续5 d检测各组细胞的增殖活性，绘制增殖曲线。与NC组相比，mir-34a组SGC-7901细胞增殖活性明显降低，从检测第3天起至第5天差异有统计学意义（t＝4.567，P＜0.01；t＝7.265，P＜0.01；t＝4.500，P＜0.01）。见图3。

2.4 mir-34a对SGC-7901细胞周期的影响通过流式细胞术检测提示，与NC组相比，mir-34a组SGC-7901细胞的G1／G0期细胞比例明显增高（t＝－4.804，P＜0.05），S期细胞比例明显减低（t＝5.149，P＜0.05），但G2／M期变化不大，表明过表达mir-34a可以导致SGC-7901细胞生长停滞于G1／ G0期。见图4。

2.5 mir-34a对SGC-7901细胞凋亡的影响通过Annexin V-APC单染法，流式细胞术检测显示，mir-34a组SGC-7901细胞凋亡率明显高于NC组（t＝－13.226，P＜0.01），表明mir-34a能够显著诱导SGC-7901细胞凋亡。见图5。

3 讨论

mir-34a是mir-34s成员之一，其编码基因位于1p36.22，该区域在多种恶性肿瘤中发生缺失［4］或在启动子区存在高度的甲基化，导致mir-34a表达异常；同时通过荧光素酶报告分析提示mir-34a的编码基因存在肿瘤抑制蛋白p53的结合位点，p53可以通过直接绑定这些结合位点诱导mir-34a表达［8］，这些均提示了mir-34a具有肿瘤抑制功能。Welch et al［9］在成神经瘤细胞中通过过表达mir-34a成功诱导了细胞凋亡。随后的多项研究［5－6］显示，mir-34a可以引起肿瘤细胞的功能抑制，包括增殖活性减弱、细胞周期停滞、细胞凋亡，同时mir-34a还可抑制EMT介导的细胞侵袭和转移［10］，并对肿瘤干细胞有明显的抑制作用［7］。

mir-34a的作用发挥存在着多样性，并可能依赖于细胞背景，比如在H1299肺癌细胞中转染了外源性mir-34a后引起了细胞凋亡，而同样的方法作用于U-2OS骨肉瘤细胞后则仅仅引起了细胞的G1期停滞［11］。故为进一步明确mir-34a在胃癌细胞中的作用，本研究首先通过RT-PCR检测了多种胃癌细胞株的mir-34a的表达，发现与正常胃黏膜上皮细胞相比，胃癌细胞中mir-34a的表达水平显著降低。这一结果提示了mir-34a作为胃癌筛查指标的可能性。之后，在胃癌SGC-7901细胞中，通过稳定转染外源性mir-34a显著抑制了胃癌细胞的增殖，诱导了细胞G1／G0期停滞及细胞凋亡。在胃癌细胞株中，mir-34a抑制增殖、诱导细胞周期停滞和细胞凋亡的作用机制，可能在于其对众多相关靶基因的负性调控。mir-34a通过其5’端的特异性序列识别靶mRNA的3’UTR区，以完全或不完全互补的方式结合并降解mRNA或抑制其翻译，在转录后水平沉默靶基因的表达。Ji et al［12］在p53突变型胃癌细胞Kato III中通过荧光素酶实验证实了抗凋亡蛋白Bcl-2是mir-34a的直接作用靶基因，通过外源性恢复mir-34a的表达，使得Bcl-2在mRNA和蛋白水平均受到了明显抑制，并最终导致细胞凋亡的增加。研究［13］证明了mir-34a在胃癌组织中呈低表达，并在胃癌AGS细胞中证实了mir-34a通过靶作用于血小板生长因子受体PDGFR和酪氨酸激酶受体MET而阻碍了PI3K／AKT通路的激活，从而抑制了胃癌细胞的侵袭和转移。研究［14］显示mir-34a在顺铂耐药的胃癌细胞株中表达量明显减低，过表达mir-34a可以提高胃癌细胞对顺铂的化疗敏感性，而这一机制可能是通过mir-34a靶作用于生存素survivin而实现。但亦有报道［15］表明，高mir-34a表达出现在肝细胞癌中，并与癌症的进展呈正相关性，这使得mir-34a肿瘤抑制者的角色受到质疑。本研究证实，mir-34a对胃癌SGC-7901细胞功能产生抑制作用，但确切机制尚不清楚，为此将进一步探讨mir-34a对胃癌SGC-7901细胞功能抑制的机制。

由于在p53突变型恶性肿瘤细胞中mir-34a的匮乏，使得重新引入、恢复mir-34a的表达有可能成为一种新的肿瘤治疗方法。目前，MIX34已作为首个治疗性microRNA用于不能手术切除的原发性肝癌或转移性肝癌治疗研究的一期实验（http：／／clinicaltrials.gov／ct2／show／NCT01829971）。本研究显示了mir-34a对胃癌细胞的抑制作用，提示通过微小RNA在肿瘤中的表观遗传调控机制，建立起胃癌新型诊治方法的可能性。而这一目标的实现，有赖于从体外研究发展至更多样本量的活体内研究，以此为miRNA用于胃癌治疗提供更为充分的依据。

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Effects ofm iRNA-34a on the proliferation and apoptosis of gastric cancer SGC-7901 cells

Deng Xiaojing1，2，Deng Min2，Song Yulin1，et al
（1Dept of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Anhui Key Laboratory of Digestive Diseases，Hefei 230022；2Deptof Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233004）

Objective To investigate the expression level ofmicroRNA-34a（miRNA-34a，mir-34a）in human gastric cancer cell lines，and explore the role ofmir-34a on the proliferation and apoptosis of human gastric cancer cell line SGC-7901.MethodsThe expression levels ofmir-34a in human gastricmucosal epithelial cells GESand human gastric cancer cell lines AGS，SGC-7901，MKN-45，BGC-823 were detected by RT-PCR.Gastric cancer SGC-7901 cellswere infected with the lentiviral system expressingmir-34a in vitro.The infected cells statuswas evaluated by fluorescence microscope.The proliferation，cell cycle and apoptosis were measured by MTT and flow cytometry.ResultsCompared with GES，the expression level ofmir-34a decreased significantly in gastric cancer cell lines，especially in SGC-7901（P＜0.01）.The ratios of proliferation inhibition，cells arrested at G1／G0 phase and apoptosis were significantly increased in mir-34a lentiviral infected group compared with the negative control group（P＜0.05）.ConclusionMir-34a has lower expression level in some gastric cancer cell lines.Mir-34a can inhibit the proliferation，induce cell cycle arrest and cell apoptosis of gastric cancer cell line SGC7901.

gastric cancer；SGC-7901 cells；microRNA；microRNA-34a；proliferation；apoptosis

R 735.2

A

1000－1492（2015）08－1090－05

2015－04－08接收

安徽省优秀青年人才基金重点项目（编号：2013SQRL053ZD）

1安徽医科大学第一附属医院消化内科，安徽省消化系统疾病重点实验室，合肥 230022

2蚌埠医学院第一附属医院消化内科，蚌埠 233004

邓晓晶，女，硕士研究生，主治医师；

宋育林，男，副教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail：ylsongcn＠163.com