二株不同基因型树鼩呼肠孤病毒的分离和鉴定

刘建生，陶玉芬，李晓菲，李超Δ，李晓飞，孙晓梅，代解杰* ，刘红旗*

(1.中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所感染和免疫实验室，云南 昆明 650118;2.中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心，云南 昆明 650118)

哺乳动物呼肠孤病毒(mammalian reovirus，MRV)属于呼肠孤病毒科呼肠孤病毒属成员。MRV是无包膜双链RNA(dsRNA)病毒，有双层衣壳，呈20面体对称结构，基因组由10条独立离散的dsRNA组成。根据基因组电泳带型分布，十个基因组片段分成L(大)、M(中)和S(小)三组，其中L组包括 L1，L2和 L3三个片段，M 组包括 M1、M2和 M3三个片段，S组包括 S1、S2、S3和S4四个片段。片段S1编码蛋白sigma1［1］，尽管该蛋白在整个病毒粒子中仅仅含有24个分子，但由于其分布在病毒粒子的表面，因此具有很重要的作用，如:细胞受体的配体［2］、血凝素［3］、诱导中和抗体的产生［4］、决定组织噬性和毒力［5，6］、介导病毒粒子与细胞微管之间的结合［7］以及抑制宿主细胞 DNA的合成［8］等。该蛋白的另一个有趣的特征是，它是唯一一个与病毒血清型特异性有关的蛋白［9－11］，根据该蛋白可以将MRV分为3个明显不同的血清型，而且编码该蛋白的基因S1在进化中起重要作用。根据血清中和试验和血凝抑制能力，呼肠病毒属可分为3个血清型，其原型株分别为Ⅰ型 T1L、Ⅱ型 T2J、Ⅲ型T3D［12，13］。

MRV最早于1954年从健康儿童的粪便中分离得到［14］。迄今为止，MRV已在许多健康或发病的哺乳动物中发现，包括人、鼠、猫、犬、猪、牛、蝙蝠及树鼩［15－22］等多种动物，通常情况下，该病毒能感染大多数哺乳动物，但一般仅在幼体感染者中引起疾病［13］。猴肾细胞(Vero)是目前分离和培养该病毒最常用的细胞。

本研究在对实验树鼩腹泻粪便样本进行病毒分离培养过程中，同一树鼩粪便样品在不同细胞上分离获得具有不同S1基因片段电泳带型特征的病毒株，并以该树鼩呼肠病毒分离株为材料，获得了S1基因组片段的全长cDNA克隆并完成了序列测定，生物信息学分析，可确认该研究中实验树鼩混合感染了呼肠病毒I型和Ⅲ型病毒。

1 材料与方法

1.1 标本

实验树鼩腹泻粪便样本由中国医学科学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心采集提供。病毒保存在中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所感染与免疫学研究室。

1.2 病毒分离培养

用DMEM基础培养基制备10%粪便悬液，6137 r/min离心20 min后，上清经0.22 μm滤膜过滤除菌，然后取200 μL滤液分别接种至6孔板中已长成致密单层的LLC－MK2、KMB17和Vero细胞，传代适应培养至第3代，均产生明显的细胞病变效应。收集细胞病毒培养物，－20℃保存备用。

1.3 病毒电镜检查

建立稳定的细胞－病毒培养体系后，分别收集培养上清和病毒感染的细胞进行透射电镜检查。培养上清直接镜检:取培养上清，3000 r/min离心20 min，弃沉淀;离心上清再经12000 r/min离心20 min，去上清，病毒沉淀经磷钨酸负染后电镜观察。病毒感染细胞超薄切片透射电镜观察:收集病毒感染3～4 d的细胞，1500 r/min低速离心15 min，弃去上清，加入4℃预冷的2.5%戊二醛固定液1 mL，不冲散细胞团块，进行超薄切片及透射电镜检查。

1.4 轮状病毒检测

按照A群轮状病毒诊断试剂盒(胶体金法)(北京万泰生物药业有限公司)使用说明检测病毒分离培养样品。

1.5 病毒RNA提取

按Axygen Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit操作说明提取培养上清中病毒RNA。用60 μL无RNA酶的超纯水重悬。保存于－80℃备用(用于RT－PCR 和 RNA－PAGE 电泳)。

1.6 病毒RNA电泳及硝酸银染色

配制聚丙烯酰胺凝胶:10%分离胶和5%浓缩胶，病毒RNA上样每孔15 μL，在1× TBE缓冲液中，于90 V电压电泳9 h后进行硝酸银染色分析。

1.7 引物设计及合成

依据呼肠病毒原型株T1L株(GenBank登录号EF494445)，T2J株(GenBank登录号 M10261)和T3D株(GenBank登录号HM159619)，设计针对哺乳动物呼肠病毒基因组片段S1全长的引物(表1)。引物Invitrogen上海公司合成。

表1 呼肠病毒S1全长基因序列引物Tab.1 Primers used for RT－PCR of reovirus S1 complete sequences

1.8 病毒基因组S1节段全长基因RT-PCR扩增

RT－PCR试剂购自TaKaRa宝生物大连有限公司。RT反应:在PCR反应管中依次加入下列成分:病毒RNA模板5 μL，灭菌蒸馏水3 μL，下游特异引物 1 μL(20 μmol/L)，dNTP mix 1 μL(10 μmol/L)，混匀，65℃作用5 min，冰上急冷2 min;再加入5×PrimeScript buffer 4 μL，RNase inhibitor 0.5 μL，PrimeScript Transcriptase 1 μL，灭菌蒸馏水4.5 μL，混匀，42℃ 45 min，70℃ 15 min。PCR 反应采用25 μL体积体系，依次加入 TaKaRa Premix Taq 12.5 μL，上下游引物各1 μL(20 μmol/L)，病毒cDNA模板5 μL，灭菌超纯水补足至25 μL。按如下反应程序扩增:94℃ 预变性 5 min;94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃1min 40 s，进行30个循环;72℃延伸10 min。取扩增产物5 μL，于1.0%琼脂糖电泳分析。

1.9 病毒S1全长基因克隆

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，将预期目的条带胶回收，克隆到pMD－T载体，经蓝白斑筛选，挑取阳性克隆菌落在氨苄抗性培养基中摇菌过夜，提取质粒。鉴定阳性的质粒交由上海生工生物工程有限公司序列测定。

1.10 生物信息学分析

通过MEGA6.0软件中blast功能收集与本研究相关的序列，选择具有S1基因片段全长的序列用于后续分析。根据Genbank的信息和发表的文献所得到的信息，给每个分离株序列一个名称:血清型/分离株/分离地点/分离年代－Genbank号(gi号)。通过MEGA6.0软件中Maximum Likelihood方法绘制遗传发生树。

2 结果

2.1 腹泻树鼩粪便样品能引起明显的细胞病变

不同的病毒可能适应不同的细胞株，为了能够尽可能多地分离到树鼩腹泻粪便中的病毒。我们将处理后的粪便样品分别在 KMB17、Vero和 LLCMK2细胞上进行3次盲传后，发现3个细胞系均出现了明显的细胞病变(图1)。

图1 树鼩粪便T28致3种细胞病变效应Fig.1 Cytopathic effects of the fecal sample T28 on the three cell lines

2.2 树鼩病毒的电镜检查

为了确定细胞病变是由病毒感染所致，我们收集有细胞病变的细胞上清，浓缩，磷钨酸负染后电镜观察病毒粒子形态。如图2A所示，病毒粒子呈轮状，具有双层衣壳结构，直径约为70 nm，具有呼肠孤病毒科的形态特征。感染了病毒的细胞电镜检查结果表明病毒主要在胞质内大量增殖(图2B)。

2.3 轮状病毒检测

A群轮状病毒是临床引起腹泻的一种主要轮状病毒，而该病毒在形态和大小上与MRV非常相似。因此，我们用A群轮状病毒特异性的试剂盒检测有病变的细胞上清。结果显示A型轮状病毒阴性。

2.4 病毒RNA电泳及硝酸银染色

呼肠孤病毒科的病毒基因组为分节段RNA，该家族成员的基因组RNA经PAGE电泳后，呈现出特异性的条带模式。因此，我们用RNA电泳的方法对分离到的病毒进一步鉴定。结果发现，3种细胞分离到的病毒RNA都呈现出哺乳动物正呼肠孤病毒基因组3个L节段，3个M节段和4个S节段的特征性模式(见图3A)。然而，我们发现，从3个细胞系中分离到的病毒基因组RNA的短片段S的S1节段表现出2种不同的迁移率，LLC－MK2和Vero细胞上扩增到的病毒S1节段迁移率较KMB17细胞上的病毒的快，这暗示该树鼩粪便样品中可能存在2种不同基因型的正呼肠孤病毒。

注:A.培养上清负染(1 cm=100 nm);B.细胞超薄切片(1 cm=2 μm)。图2 病毒感染的KMB17细胞及其培养上清透射电镜Note.A.Culture supernatant by negative staining，scale bar 1 cm=100 nm;B.Ultra－thin section of infected KMB17 cells，scale bar 1 cm=2 μm.Fig.2 The viral particles in culture supernatant and in the cytoplasm of infected KMB17 cells revealed by transmission electron microscopy

2.5 病毒S1全长基因RT-PCR扩增

为了进一步确定分离到的病毒的基因型，根据已报道的型特异性S1基因节段序列设计了分别针对I、II和III型病毒的特异性引物，对病毒基因组RNA进行RT－PCR扩增。结果发现，只有I和III型特异性引物能扩增出预期大小的片段，未见II引物扩增出的产物(图3B)。与RNA的电泳结果类似，LLC－MK2和Vero细胞上扩增到的病毒RNA只有Ⅲ型引物能扩增得到预期大小的目的片段，且二者的大小一致;而KMB17细胞上扩增得到的病毒RNA只有I型引物能扩增得到预期大小的片段(图3B)。这一结果不仅表明了我们从树鼩中分离到了呼肠孤病毒，而且可能存在2种不同基因型。

2.6 树鼩呼肠病毒S1全长基因序列分析

为进一步研究分离到的树鼩呼肠孤病毒与已报道的呼肠孤病毒之间的遗传关系，我们对扩增得到的S1全长基因进行克隆、测序和序列分析。结果表明，KMB17培养上清中，通过I型引物能扩增得到全长1463 bp的血清型别特异性S1基因片段，比对结果表明，该序列与GenBank中哺乳动物呼肠病毒I型原型株T1L(EF494445)同源性最高，核苷酸序列同源性为85%，氨基酸序列同源性为90%，因此将该病毒定型为树鼩呼肠孤病毒I型，命名T1/T28－1/Tupaia/Kunming/2013 (GenBank，登 录 号KP185123)。LLC－MK2和Vero细胞上清中的病毒，通过III型引物能扩增得到1416 bp的S1全长基因，比对结果表明，这两株适应培养病毒S1基因完全同源，与GenBank库中哺乳动物呼肠孤病毒Ⅲ型原型株T3D(HM159619)核苷酸同源性为85%，氨基酸同源性为92%，因此该病毒定型为树鼩呼肠孤病毒III型，分别命名 T3/T28－2/Tupaia/Kunming/2013(Gen－Bank，登录号 KP185124)和 T3/T28－3/Tupaia/Kunming/2013(GenBank，登录号 KP185124)。

注:A.病毒基因组RNA聚丙烯酰胺凝胶电泳;B.病毒基因组S1片段RT－PCR分析。图3 树鼩粪便样品T28细胞培养上清病毒基因组分析Note.A.RNA PAGE analysis of viral genomes;B.RT－PCR analysis of genomic S1 fragment of virusesFig.3 Genomic analysis of viruses in the supernatant of Tupaia fecal sample T28－inoculated cells.

采用Maximum Likelihood方法，对本研究获得的2株病毒的S1节段基因序列分别与GenBank中具有全长S1基因序列的哺乳动物呼肠病毒I型和III型病毒进行遗传进化分析。结果表明，我们分离到的I型病毒株T1/T28－1/Tupaia/Kunming/2013单独成簇，与T1L原型株和中国2011年雪貂分离株的关系较近，而与2011年中国猪源分离株SHR－A遗传距离相对远一些(图4A)。III型病毒S1基因片段可以明显地分2个大组，第一组(GI)分别由美国分离株(GIa)和亚洲分离株(GIb)组成，第二组(GII)的病毒全部来自欧洲。我们分离到的III型病毒株T3/T28－2/Tupaia/Kunming/2013虽然与亚洲的其他分离株形成了明显的一簇，但它也单独形成一个进化分支(图4B)。这些结果表明我们分离到的2株不同基因型的MRV均已进化适应了树鼩宿主。

注:A.I型病毒;B.III型病毒;代表本研究的分离株。图4 呼肠病毒S1基因全长核苷酸序列的种系进化分析Note.A.Serotype I;B.Serotype III;Represents viruses isolated in this study.Fig.4 Phylogenetic trees based on full length of S1 nucleotide sequences of mammalian orthoreovirus

3 讨论

本研究通过 KMB17、Vero和 LLC－MK2三种不同的细胞系对一个腹泻树鼩的粪便样品进行病毒分离，结果发现3个细胞均表现不同程度的细胞病变。经透射电子显微镜观察、病毒基因组RNA PAGE电泳和病毒基因组S1片段的序列分析，证实我们从腹泻树鼩的粪便样品中分离到的是I型和III型哺乳动物正呼肠孤病毒。

细胞是病毒分离的常用工具，不同的细胞适合分离不同类型的病毒。Vero细胞适于多种病毒的分离，包括:正呼肠孤病毒、轮状病毒、肠道病毒等。另外，同一病毒在不同细胞中复制情况可能不一样。以前报道显示通过Vero细胞从树鼩粪便样品中分离到正呼肠孤病毒［21］。多种病毒可以引起腹泻性疾病，为了弄清可能引起树鼩腹泻的病毒，我们采用了3个常用于病毒分离的细胞系KMB17、Vero和LLC－MK2对粪便样品里的病毒进行扩增和鉴定，发现了2种基因型正呼肠孤病毒存在于树鼩的腹泻样品中，其中I型分离株T1/T28－1/Tupaia/Kunming/2013能在KBM17细胞上适应增殖，而III型分离株T3/T28－2/Tupaia/Kunming/2013则能在 Vero、LLC－MK2细胞上适应增殖。KMB17细胞为人胚肺二倍体成纤维细胞，而Vero细胞为非洲绿猴肾上皮细胞，LLC－MK2为猕猴肾上皮细胞，这对以后通过组织培养进行哺乳动物呼肠病毒分离鉴定和选用适宜的细胞具有指导借鉴意义。

血清中和试验和血凝抑制试验是对哺乳动物呼肠孤病毒I型、II型和III型进行血清型别鉴定的传统实验方法。我们参考相关文献设计引物扩增了哺乳动物呼肠病毒型特异性抗原的编码基因S1片段全长，并通过克隆、测序及核苷酸同源性分析，发现我们分离到的病毒株为哺乳动物呼肠孤I型和III型病毒。因为S1蛋白是唯一一个与病毒血清型特异性有关的蛋白［9－11］，所以本研究 RT－PCR 方法对于树鼩MRV的血清型鉴定起非常重要的作用。

S1基因片段有2个 ORFs，编码黏附蛋白 σ1和非结构蛋白 σ1s。σ1蛋白呈纤维状，其球状头部有两个独立的细胞表面受体结合区域，分别为连接粘附分子结合域和唾液酸分子结合域［23］。σ1蛋白是病毒黏附蛋白，介导病毒对宿主细胞的入侵。σ1蛋白的这两个结合域，在不同毒株之间的分布和结构不同。本实验研究中，I型毒株与III型毒株之间σ1蛋白氨基酸同源性仅为27%，而 I型毒株在KMB17人二倍体成纤维细胞上有选择性的适应生长，III型毒株则在Vero、LLC－MK2猴肾上皮细胞上适应生长，可能与它们的S1基因所编码的σ1病毒黏附蛋白的结构及细胞表面受体特征有关，有待进一步的研究。

呼肠孤病毒S1基因片段与病毒的血清型密切相关，本研究通过BLAST找到了12株已知的I型病毒S1基因全长序列，分析发现我们的分离株与我国最近报道从雪貂分离到的3株病毒以及T1L型原型株关系较近，而与中国的猪分离株关系相对较远一些。然而由于I型病毒的S1基因片段序列的数目较少，不能发现各个分离株之间明显的关系。

综上所述，本研究首次通过多种细胞对腹泻树鼩的粪便样品进行病毒的分离和鉴定，并且同时获得了I型和III型的正呼肠孤病毒，这些结果一方面为诊断树鼩的腹泻提供了强有力的证据，然而确定哪型病毒与树鼩的腹泻有关，还需要更深入的研究，另一方面对于将来通过细胞培养分离鉴定正呼肠孤病毒时细胞的选择有很好的指导作用。

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