不同浓度葡聚糖硫酸钠对小鼠炎症性肠病模型建立及其致病相关免疫因子表达的影响

李欣，武文卿，张卓超，俎占飞，毛旭燕，朱恒 ，宁守斌*

1.中国人民解放军空军总医院消化科，北京 100142;2.军事医学科学院科技部，北京 100850;3.军事医学科学院基础医学研究所，北京 100850)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一组发病原因尚不明确的慢性非特异性的炎症性疾病，主要包括克罗恩病(Crohn’s disease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)，其发生发展与遗传易感性、外部环境、感染介质、肠道共生菌及免疫系统的功能障碍等多因素相互作用有关［1］，主要临床症状为腹痛、腹泻、粘液脓血便、体重减轻，长期发展亦有癌变的风险［2］，因此IBD相关研究日益受到重视。采用动物模型开展研究具有受伦理学限制少，便于取材等优势。目前常用葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)溶于水中给予小鼠饮用建立IBD模型，其病理改变与人临床病理改变接近［3］。但是，不同研究小组建立DSS诱导的 IBD模型的方法并不统一，所用小鼠周龄(4～16周)、小鼠品系(KM、BALB/c、C57BL/6和 C57BL/10等)、DSS浓度(2% ～10%)和自由饮水时间(5～10 d)等多个因素均不相同，成模率也高低不等，这些不利于利用动物模型开展炎症性肠病的研究。

我们在大量调研文献的基础上，通过采用不同浓度的DSS溶液自由饮用以建立炎症性肠病C57小鼠模型，系统探讨DSS浓度对IBD成模率和动物死亡率及致病相关免疫因子表达的影响，以期筛选出成模稳定、可操作性好、成模率高的模型，从而为IBD的治疗研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级雄性C57BL/6J小鼠64只，19～21 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供［SCXK:(京)2012－0001］，动物实验场所号为SYXK－军2012－0065。喂养前适应性喂养3～5 d。DSS购自默克公司，相对分子质量为36×103～50×103白色粉末状固体，DSS与去离子水分别配置浓度为3%、5%、7%的DSS水溶液。

1.2 动物分组

对照组(n=16):自由饮水组;实验－1组(n=16):3%－DSS 溶液组;实验－2 组(n=16):5%DSS 溶液;实验－3组(n=16):7%DSS溶液组。

1.3 DSS诱导小鼠IBD模型制备

小鼠自由饮用3%、5%、7%DSS溶液，建立IBD模型，新鲜的DSS溶液每隔1 d更换1次，正常对照组小鼠饮用去离子水。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 一般指标

观察小鼠大便性状、体重改变和生存情况。

1.4.2 小鼠结肠组织大体观察及评分

DSS诱导的IBD小鼠模型其结肠大体病理改变主要为结肠缩短和水肿，Egger等研究发现IBD小鼠结肠的长度变化可以用来评价炎症严重程度。模型建立的第6天处死小鼠，取出结肠部分，观察结肠的大体形态，测量肛门至盲肠末端的长度。病理评分按照Morris［4］的评分标准进行:0分:基本正常;1分局部充血，未见溃疡;2分无充血，有溃疡;3分:溃疡和炎症仅有1处;4分:有两处以上的溃疡和炎症;5分:溃疡长度大于2 cm;6～10分:大于2 cm的溃疡，每增加1 cm多计1分。

1.4.3 小鼠结肠组织学观察及评分

随机取含病变肠组织并去除肠内容物，以4%中性甲醛固定，石蜡包埋切片，行苏木素伊红(HE)染色。组织学评分按照Scheiffele等［5］的评分标准进行:0分:无显著炎症;1分:仅见少量淋巴细胞浸润(高倍视野，≤10%)，其无肠壁结构改变:2分:中等数量的淋巴细胞浸润(高倍视野，10% ～25%)，肠壁增厚，肠隐窝变长，但无透过黏膜层的溃疡;3分:显著的淋巴细胞浸润(高倍视野，25% ～50%)，肠壁增厚，血管密度增加:4分:肠壁内可见大量的淋巴细胞浸润全层(高倍视野，≥50%)，肠隐窝变长并扭曲，有溃疡形成，肠壁全层增厚，血管密度增加。

1.4.4 小鼠脾细胞炎症因子的表达检测

建模后6 d处死小鼠，解剖取脾，收集脾细胞，Trizol提取RNA，逆转录成cDNA，逆转录体系按照试剂盒说明配置，RT－PCR检测促炎因子(TNF－α、IFN－γ 和 IL－17A)，抑炎因子(IL－4 和 IL－10)以及调节性T细胞相关的转录因子Foxp3的表达水平。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠饮水状况(见表1)

表1 各组小鼠饮水量(n=16)Tab.1 The drinking amount of the mice in each group

2.2 小鼠一般状况

对照组小鼠精神活跃，大便性状正常，毛发光泽好且顺滑。

3%DSS组小鼠造模后精神稍差，多为半稀便，少许粘肛，可见轻微的肉眼血便。

5%DSS组小鼠造模后精神差、懒惰，肉眼血便，饮食减少，部分小鼠出现竖毛、弓背现象。

7%DSS组小鼠造模后精神倦怠，懒惰，拱背，扎堆，毛发无光泽、竖毛现象，可见明显肉眼纯稀血便。

2.3 小鼠体重变化

各组小鼠自由饮用不同浓度的DSS溶液后体重变化(见图1)。

对照组小鼠体重持续增加，实验组小鼠DSS(3%、5%、7%)组前3 d体重均缓慢增加，4 d体重迅速下降，且随着DSS浓度的增加小鼠体重下降幅度越大。第6天时，3%DSS、5%DSS、7%DSS 饮用组的小鼠体重降低百分率分别为16.26%、17.95%、20.62%。

图1 各组小鼠体重改变Fig.1 Changes of body weight of the mice in each group

2.4 结肠大体病理学观察

各组小鼠结肠肉眼大体形态观见(图2)实验组与对照组相比结肠明显缩短。进一步观察可见，对照组小鼠结肠肠壁较薄，颜色红润，褶皱清晰;3%DSS组小鼠肠壁水肿，褶皱变浅，轻微充血;5%DSS组小鼠肠腔充血水肿，可见溃疡，伴有少量坏死;7%DSS组小鼠肠腔可见明显溃疡，伴有大面积坏死，局部肠壁增厚，肠腔狭窄。

大体形态学和组织学评分结果如(表2)所示，可见随着饮用的DSS溶液浓度的提升，小鼠结肠的大体病理损害逐渐加重。

表2 炎症性肠病小鼠结肠评分(，n=16)Tab.2 The scores of IBD colons

表2 炎症性肠病小鼠结肠评分(，n=16)Tab.2 The scores of IBD colons

组别Groups成模率/%Modeling success rate对照组Control Group 0.0 0.0 03%DSS组3%DSS Group 3.54±0.07 2.53±0.38 1005%DSS组5%DSS Group 4.46±0.09 3.61±0.08 1007%DSS组大体评分General scores病理评分Pathologic scores 7%DSS Group 6.73±0.21 4.64±0.06 100

2.5 组织病理学观察

组织病理学的HE染色结果(如图3)示，对照组小鼠肠黏膜层、肌层和肠腺体结构清晰，组织结构完整;3%DSS组小鼠肠壁增厚，有炎症细胞浸润，黏膜层和肌层结构不清，肠腺体结构消失;5%DSS组小鼠肠壁水肿增厚更加明显，大量炎性细胞浸润;7%DSS组小鼠除了具有前述表现外，可见肠黏膜坏死脱落，炎性细胞浸润至全层。

2.6 IBD发病相关免疫因子的表达情况

如图4所示，定量 PCR结果表明促炎因子(TNF－α、IFN－γ 和 IL－17A)的表达水平与 DSS 浓度成正相关，而抑炎因子(IL－4和IL－10)以及调节性T细胞相关的转录因子Foxp3的表达水平与DSS浓度成负相关关系。

图2 各组小鼠结肠大体形态观Fig.2 Gross appearance of the colon in the mice

图3 各组小鼠组织病理分析Fig.3 Histological analysis of the colon in the mice of each groupe.Bar=100 μm

图4 各组免疫分子mRNA相对表达量(*，P＜0.05;＊＊，P＜0.01)Fig.4 The relative mRNA levels of immune factors in the mice of each group(*，P ＜0.05;＊＊，P ＜0.01).

2.7 各组小鼠生存率

建模第6天时，饮用不同浓度DSS的小鼠的病理表现均表现为典型的炎性肠病损害。但是，各组小鼠的死亡率出现差异，分别为:3%组为18.2%，5%组为33.3%，7%组为50%，以7%组的死亡率分别和3%组以及5%组进行比较，发现这种差别具有统计学意义(图5)(P＜0.05)。

图5 各组小鼠存活百分率Fig.5 Survival curves of the mice in each group

3 讨论

IBD的发病机制至今尚无定论，现认为可能与环境、遗传、微生物感染及免疫等多种因素有关，其中，免疫因素在溃疡性结肠炎发病机制中尤为重要［6］。目前常用的模拟人类IBD的动物模型采用葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导制备，DSS是一种硫酸多聚糖，由蔗糖合成而来，其具有和肝素相似的抗凝血作用。DSS诱导结肠炎发生的具体机制不详，可能和其导致肠道菌群失调、DSS对结肠上皮的毒性作用以及巨噬细胞功能失调有关，也可能与DSS促进炎性细胞因子 TNF－α/、IFN－γ、IL－17A 等的表达及与嗜酸性细胞脱颗粒有关［7］。DSS诱导炎症性肠病模型简单易行，成功率高，重复性好，其症状、结肠肉眼病变和组织学改变均与人类IBD相似，且可人为地反复以DSS刺激，产生与人类IBD急性期和缓解期相似的病理改变［8］，是研究IBD发病机制和药物疗效比较合适的动物模型。

多项研究结果显示，DSS－IBD模型的建立主要受动物种系、DSS浓度，DSS相对分子质量，DSS暴露时间等因素的影响［9］。其中DSS浓度对模型的成功建立起着决定性的作用。本实验开展C57BL/6小鼠自由饮用去离子水、3%、5%、7%相对分子质量为36000～50000 DSS溶液造模实验，主要目的是探索最佳造模浓度和时间及探讨不同浓度的DSS对小鼠炎症因子表达的影响。通过开展本研究，我们筛选出了既能获得典型病理改变，又不牺牲过多实验动物的合理DSS给药浓度，具有良好的经济效益和动物伦理学价值。

在IBD的发生和发展过程中炎症细胞因子与抗炎细胞因子之间的平衡失调起着重要的作用，测定细胞因子 TNF－α、IFN－γ、IL－17A、IL－4、IL－10 以及调节性T细胞相关的转录因子Foxp3的表达水平的水平可反映IBD的病情变化，同时也便于开展深入的发病机制研究。以往研究表明，TNF－α、IFN－γ和IL－17A具有广泛的生物学活性，在IBD中起到促进炎症发生的作用［10］。TNF－α主要由活化的巨噬细胞和单核细胞分泌，在调节炎症反应过程中发挥重要作用。TNF－α可诱导趋化因子，促使中性粒细胞迁移到肠道的炎症区域，也可以释放血小板活化因子，促进一氧化氮、白三烯释放，并促进内皮细胞表达粘附分子，诱导血栓生成，引发肠黏膜血液循环障碍，进而导致肠道的黏膜组织广泛性损伤［11］。IFN－γ是由NK细胞和T细胞产生的一种同二聚体糖蛋白，具有较强的免疫调节活性，能够强有力的激活中性粒细胞和巨噬细胞，从而引起肠道炎症反应［12］。Th17细胞亚群分泌的IL－17A可增加细胞渗透性，促进多种趋化因子和炎症因子释放，与其他炎症因子一起发挥协同作用，放大其在IBD的致炎作用。而IL－4、IL－10以及Treg细胞起到抑制IBD发生的作用。Treg细胞有预防和减轻各种炎症反应的作用，在介导免疫耐受中发挥重要作用［13］。IL－10又名细胞因子合成抑制因子，主要免疫调节作用是抑制激活的单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、T细胞发挥有效功能。IL－10是一种重要的细胞因子合成抑制因子在黏膜免疫中可抑制激活的单核细胞、巨噬细胞、T细胞、粒细胞发挥功能从而起到稳定肠道内环境的作用［14，15］。IL－4 则可通过抑制 Th1 细胞的增殖功能进而抑制肠道炎症的发生［16］。在本研究中，不同浓度的DSS溶液诱导的IBD模型小鼠，各组炎症因子表达存在明显的剂量相关性，随着DSS浓度的增加，促炎症细胞因子表达增加而抗炎细胞因子的表达降低。本实验的结果也为探索IBD中免疫因子的作用提供了宝贵线索。

综上所述，本研究经济高效地建立了DSS诱导的小鼠IBD模型，探讨了DSS浓度与IBD致病相关免疫因子的相关性，相关研究结果为开展IBD发病机制研究以及寻找有效的IBD治疗策略提供了有力工具。

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