Rab13通过影响PKA活性调节occludin及F－actin在大鼠血睾屏障的分布

宿文辉，贾晓宇，孟晓娜

(中国医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，沈阳 110122)

血睾屏障(blood－testis barrier，BTB)位于生精上皮近基底膜处相邻支持细胞(Sertoli cell，SC)间，作为免疫屏障，BTB将生精细胞减数分裂及减数分裂后的发育过程同体循环相分隔，使这些过程在相对独立的近腔小室中进行［1，2］。BTB是哺乳动物体内最为严密的血－组织屏障之一，这有赖于支持细胞间的紧密连接(tight junction，TJ)、TJ附近的基底特化粘着链接(basal ectoplasmic specialization，basal ES)以及位于内质网与支持细胞膜间的肌动蛋白束(filamentous actin，F－actin)骨架［1，2］。在生精细胞穿越BTB进入近腔小室进一步发育的过程中，构成BTB的细胞连接复合体及肌动蛋白骨架必须经历解聚及重建的动态过程［3］，体内许多细胞因子和激素，如TNFα［4］、TGF－β3［5］、NO［6］、睾酮［2］等，就是通过调节该过程影响BTB的屏障功能。

Rab GTPase属于Ras超家族，主要参与胞内各种细胞期间的蛋白质转运及内吞、胞吐等过程［7］。在前期研究中，我们验证了Rab13 GTPase在大鼠睾丸内的表达分布随生精上皮周期的变化而变化［8］，并发现Rab13可通过影响蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)的活性调节体外培养Sertoli细胞通透性［9］。本研究采用睾丸内 shRNA注射转染沉默Rab13的表达，进一步在大鼠体内验证Rab13－PKA途径对BTB功能的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及动物

10只清洁级雄性 Sprague－Dawley大鼠，体重300 g左右，由中国医科大学实验动物部提供［SCXK(辽)2008－0005］。

BLOCK－iT U6 RNAi Entry载体购自 Invitrogen公司，无内毒素超纯质粒纯化试剂盒购自Qiagen公司，TransIT®EE Hydrodynamic Delivery Solution 为Mirus公司产品;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物试剂公司，ECL显色试剂盒购自Thermo公司，PVDF 膜为 Millipore公司产品;［γ－32P］ATP 购自北京福瑞生物科技有限公司，PKA底物肯普肽购自Enzo Biochem公司，PKA抑制剂H89购自Selleck公司;兔抗Rab13抗体购自Abcam公司;兔抗occludin、兔抗 ZO－1、小鼠抗 β－catenin 抗体、CY3 标记－驴抗兔IgG购自 Invitrogen;兔抗 N－cadherin、山羊抗β－actin抗体、牛抗兔、牛抗小鼠、牛抗山羊IgG均购自Santa Cruz公司;罗丹明－鬼笔环肽购自Sigma公司，Prolong Gold Antifade封片剂购自Invitrogen;其他常规试剂均为Sigma公司产品。

1.2 大鼠睾丸内shRNA转染沉默Rab13表达

根据本实验室已有Rab13 siRNA干扰序列［9］，采用BLOCK－iT RNAi Designer(Invitrogen)设计大鼠Rab13 shRNA(上游序列:5＇－GAUGUAAGUGCUGUUGAAGtt－3＇，下游序列:5＇－CUUCAACAGCACUUACAUCtt－3＇)及阴性对照 Ctrl shRNA(上游序列:5＇－AGGAGAUGUGAUAUUGGCUtt－3＇，下游序列:5＇－AGCCAAUAUCACAUCUCCUtt－3＇)， 均 克 隆 入BLOCK－iT U6 RNAi Entry载体，无内毒素质粒纯化试剂盒纯化。睾丸内注射前，用TransIT®EE Hydrodynamic Delivery Solution稀释shRNA载体，消毒大鼠睾丸外皮肤，28号针头量取稀释的shRNA载体溶液于睾丸尾侧端点处注射(125 μL/睾丸，含8 μg shRNA载体)，同一大鼠两侧睾丸分别注射Rab13 shRNA载体溶液(或含30 μmol/L PKA抑制剂H89的Rab13 shRNA载体溶液)及Ctrl shRNA载体溶液。24 h后(day 2)，对同一大鼠进行等量shRNA载体注射。于不同时间(day 3、day 4、day 5)处死大鼠，所取睾丸均液氮冷冻后存储于－80℃。

1.3 Western印迹

按睾丸尾侧针孔切取shRNA载体溶液注射点周围5 mm范围内组织，NP－40裂解液(50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，10% 甘油，2 mmol/L EGTA，1%Nonidet P－40，pH 8.0)冰上融化、剪碎组织块，匀浆离心后提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，制备睾丸组织蛋白样品。各组蛋白经SDS－PAGE电泳后转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，依次经一抗(Rab13 －1∶500，occludin－1∶1000，ZO－1 －1∶1000，N－cadherin－1∶500，β－catenin－1∶1000，β－actin－1∶500)、二抗孵育(1∶3000)，ECL显色，β－actin作为蛋白内参照。

1.4 同位素掺入法测定PKA激酶活性

放射自显影以肯普肽为底物测定PKA活性:上述睾丸组织裂解液稀释至0.5 g/L，取7.5 μg蛋白裂解液加入50 μL PKA 反应液(54 mmol/L β－甘油磷酸盐，14.5 mmol/L对硝基苯磷酸盐，24 mmol/L吗啉代丙烷磺酸，14.5 mmol/L MgCl2，14.5 mmol/L乙撑双四乙酸，0.12 mmol/L乙二胺四乙酸，1 mmol/L二硫苏糖醇，75 μmol/L酪氨酸蛋白酶抑制剂，10 μmol/L ML－9，1 g/L 肯普肽，1 mg/L 蛋白酶抑制剂，pH 7.2)，混匀后加入 50 μCi/mL ［γ－32P］ATP，于37℃孵育30 min，加入等量样品缓冲液终止反应，SDS－PAGE分离肯普肽，晾干后放射自显影，凝胶分析系统读取肯普肽相应自显影带，代表PKA活性。

同时通过同位素液闪计数验证肯普肽的磷酸化程度:取5 μL上述裂解液加入25 μL PKA反应液，混匀后加入 25 μL 20 μCi/mL ［γ－32P］ATP，于 30℃水浴7 min，各处理组取25 μL反应液滴与Whatman p81滤纸，5%磷酸溶液终止反应，充分清洗后使用Beckman液闪计数仪读取滤纸γ－32P含量，以反映肯普肽的磷酸化程度。

1.5 睾丸组织免疫荧光染色检测occludin在大鼠生精上皮的分布

液氮中取出day 5处死的大鼠睾丸，于－22℃冰冻切片(7 μm)，展开切片平铺于载玻片上，4%多聚甲醛室温固定10 min。0.1%Triton－100通透处理4 min后，用5%BSA封闭30 min，兔抗occludin抗体(1∶100，1%BSA 稀释)于4℃孵育过夜，CY3标记驴抗兔IgG(1∶150，1%BSA稀释)室温孵育1 h，Prolong Gold Antifade封片剂(含 DAPI)封片，O－lympus BX60荧光显微镜下观察记录结果。每次实验(共3次)均在注射点周围5 mm范围内随机选取50个小管进行观察。

1.6 睾丸组织鬼笔环肽染色检测F-actin在大鼠生精上皮的分布

如上述方法制作冰冻切片，经固定、通透处理后，使用罗丹明标记的鬼笔环肽(1∶200，1%BSA稀释)室温孵育1 h，Prolong Gold Antifade封片剂(含DAPI)封片，Olympus BX60荧光显微镜下观察记录结果。

2 结果

2.1 大鼠睾丸内Rab13沉默效果及其对BTB相关连接蛋白表达量的影响

为研究Rab13对大鼠BTB功能的影响，本研究采用睾丸内shRNA转染以实现在睾丸组织局部Rab13的沉默。通过将Rab13 shRNA载体及转染试剂注射入大鼠睾丸实质，选取注射点周围组织进行Western印迹分析，发现与对照RNAi组相比，Rab13 RNAi组Rab13的表达量显著下降(约70%左右)，说明该方法可以干扰睾丸内Rab13的表达(图1)。同时，BTB 相关连接蛋白 occludin、ZO－1、N－cadherin及β－catenin的表达量在Rab13沉默前后并无改变，说明Rab13不能通过调节这些连接蛋白的表达影响BTB功能，亦表明本研究所用Rab13 shRNA无靶外效应(图1)。

注:＊＊P﹤0.01，与对照RNA干扰组比较。图1 Western印迹检测Rab13睾丸内沉默后BTB主要连接蛋白表达水平Note.＊＊P﹤0.01，compared with the Ctrl RNAi group.Fig.1 Western blot analysis of the junction proteins of BTB after Rab13 RNAi silencing in the testis

2.2 Rab13睾丸内沉默引起PKA活性升高

经连续2 d在大鼠睾丸内注射shRNA载体后，于第3、4、5天分别处死动物取睾丸组织，通过同位素掺入法以肯普肽为底物检测PKA活性。放射自显影(图2，a)及液闪计数(图2，b)结果均显示Rab13沉默后睾丸组织内PKA活性明显升高，该结果与本实验室体外Sertoli细胞中研究结果相一致［9］，说明Rab13可能通过调节PKA活性影响BTB功能。

注:放射自显影(a)与液闪计数(b)测定PKA活性，*P﹤0.05，＊＊P﹤0.01，与对照RNA干扰组比较。图2 同位素掺入实验测定Rab13沉默后睾丸组织PKA活性变化Note.Autoradiography(a)and scintillation counting(b)to detect PKA activity，*P﹤ 0.05，＊＊P﹤ 0.01，compared with the Ctrl RNAi group.Fig.2 Autoradiographic experiment to determine the PKA activity in the testis after Rab13 silencing

2.3 Rab13通过PKA调节紧密连接蛋白occludin在大鼠BTB的分布

为明确Rab13对BTB的调节机制，本研究采用免疫荧光染色检测了BTB紧密连接蛋白occludin在Rab13沉默后的分布变化。根据occludin在正常大鼠的生精上皮周期依赖性的表达规律，即在VIII期生精上皮中表达量显著下降［10］，我们观察了Rab13沉默后不同期别生精上皮中occludin的表达分布。结果发现在 VII－VIII期生精上皮中，Rab13 RNAi组occludin在BTB处的分布明显高于对照组(图3，a vs.b)，而在其他期别的生精上皮中occludin的分布与对照组相比并无显著改变(图3，d vs.e)。我们同时观察到，如在沉默Rab13的同时使用H89抑制PKA的活性，则occludin在任何期别生精上皮中的分布均无明显变化(图3，a vs.c，d vs.f)。这些结果表明，Rab13可能通过调节PKA的活性影响大鼠VIII期生精上皮BTB的动态变化，进而影响前细线期精母细胞进入近腔小室进一步分化发育。

2.4 Rab13通过PKA调节肌动蛋白骨架在大鼠BTB的分布

本实验室前期研究表明Rab13可以通过PKA影响体外培养 Sertoli细胞 F－actin的排布［9］，因此本研究中采用鬼笔环肽染色检测了Rab13沉默后大鼠BTB中F－actin骨架的变化。结果发现，Rab13沉默后F－actin在BTB处的分布更为集中(图4，a vs.b)，而PKA抑制剂H89可拮抗此效应(图4，a vs.c)。该结果与体外研究结果相一致，提示Rab13－PKA途径可通过影响F－actin骨架调节大鼠BTB功能。

3 讨论

生精小管是哺乳动物睾丸的基本功能单位，精子发生是生精小管上皮内复杂的生物学过程，这一过程受到下丘脑－垂体－睾丸轴的严密调控［11］。在组织结构上，血睾屏障(BTB)将生精上皮分为两部分，即基底小室与近腔小室，这种特征使精母细胞的减数分裂以及随后的各级生精细胞发育可以在相对独立的近腔小室内进行，与体循环相分隔。BTB组成了一道天然的免疫屏障，可将大部分生精细胞的自身抗原与免疫系统隔离，避免了自身免疫反应的发生［12］。然而，在整个生精上皮周期中，BTB并不是一直保持关闭状态的，比如在大鼠VIII期生精上皮，需要重建BTB以使存在于基底小室内的前细线期精母细胞跨越BTB进入近腔小室内继续发育［13］。研究发现，此过程包括移行精母细胞后方“新”BTB的形成及其前方“旧”BTB的分解，且必须受到严密的调控以保证生殖细胞的穿越，同时避免免疫细胞或分子的通过［14］。因此，BTB的“开关”对血睾屏障功能的维持至关重要。

注:VII－VIII期(a－c)与 IV－V 期(d－f)生精上皮中 occludin 的分布。图3 免疫荧光检测Rab13沉默后occludin在大鼠BTB的分布(bar=50 μm)Note.Stage VII－VIII(a－c)and stage IV－V(d－f)seminiferous epithelium.Fig.3 Immunofluorescence analysis to detect the occludin distribution at BTB after Rab13 RNAi silencing in the rat testis

图4 罗丹明－鬼笔环肽染色检测Rab13沉默后F－actin在大鼠BTB的分布(bar=50 μm)Fig.4 Rhodamine－conjugated phalloidin staining to detect the F－actin distribution at BTB after Rab13 RNAi silencing in the rat testis

生精上皮内各种细胞连接的有序分解与重建受到体内多种因素的调节，如细胞因子［15］(TNFα、TGF－β3)、睾酮［15］、肌动蛋白调节蛋白(Eps8［16］、Arp2/3［17］、drebrin E［18］、filamin A［19］)、蛋白酪氨酸激酶(c－Yes［20］、FAK［21］)等，这些因素主要通过间接或直接调节连接蛋白的胞内转运或细胞连接处肌动蛋白丝的排布发挥作用。Rab GTPase是一族相对分子质量为(20～30)×103的GTP结合蛋白，在研究上皮细胞紧密连接的过程中，人们发现了多种Rab GTPase在连接复合体中的定位，并发现有多种Rab GTPase参与调节紧密连接功能变化［7］。我们在前期研究中已验证了Rab13在大鼠生精上皮中的表达［8］，并采用原代培养的大鼠 Sertoli细胞，发现睾酮增强体外BTB屏障功能的过程伴有Rab13的表达下调和PKA活性的升高。在培养SC中采用siRNA沉默Rab13的表达后，可显著增强体外BTB屏障功能，形态学结果表明Rab13对SC功能的影响可能是通过改变肌动蛋白骨架及紧密连接蛋白occludin在细胞连接处的分布［9］。

基于上述体外研究结果，本研究旨在在大鼠体内验证Rab13对BTB功能的影响。目前，已有多篇文献报道shRNA睾丸内注射转染在BTB功能研究上的应用，通过在大鼠睾丸一端将转染试剂与shRNA载体注射入睾丸实质，实现在睾丸局部沉默靶基因表达的目的［16，19，22］。我们根据已证明有效的Rab13 siRNA 序列［9］，构建 shRNA 表达载体，睾丸内转染后发现Rab13蛋白水平与对照组相比下降约70%。此外，与体外实验结果一致，Rab13沉默后睾丸组织裂解液中PKA活性与对照组相比亦有明显下降，提示Rab13可能通过影响PKA活性调节BTB功能。

相邻支持细胞间的紧密连接(TJ)是赋予BTB屏障功能最重要的细胞连接结构，occludin、claudins和JAMs三种跨膜蛋白以及ZO－1、ZO－2等周边蛋白在调节BTB的有序开放中发挥了重要作用，它们既作为TJ的结构成分，又发挥着信号转导的功能。其中，occludin在BTB的表达具有典型的生精上皮周期依赖性，即在大鼠VIII－XI期生精上皮中，occludin的表达显著低于其他期别，这种表达模式有助于协调该阶段BTB的重建及前细线期精母细胞通过Sertoli细胞间的紧密连接进入近腔小室［10］。在对睾丸内Rab13的表达进行干扰后，我们进一步采用免疫荧光检测了occludin在生精上皮的分布，结果发现在VIII期生精上皮中occludin在BTB的分布显著高于对照组，而在其他期别生精上皮occludin的分布并无明显变化。在大鼠睾丸，VIII期生精上皮所占比例仅为7% ～10%［23］，因此我们在Western印迹中并未检测到Rab13沉默后睾丸组织总体occludin水平有显著变化。此外，Rab13沉默后生精上皮近基底部的F－actin分布也有明显增多，该变化可能有助于“加固”Sertoli细胞间的连接结构。据此，我们推测Rab13－PKA途径可以通过影响occludin和F－actin骨架参与大鼠BTB的周期性重建，进而调节生精细胞在生精上皮内的发育过程。

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