黄芩素对人肺癌细胞A549的增殖抑制作用及细胞周期的影响

覃太敏，冉瑞智

（1.湖北恩施州卫生学校，湖北 恩施 445000；2.湖北省恩施州中心医院肿瘤科，湖北 恩施 445000）

肺癌是当今对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤。黄芩素（baicalein）是从唇形科植物黄芩干燥根中提取的黄酮类化合物，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗变态反应、抗氧化、抗凝、抗血栓形成等多种药理活性［1-2］。研究显示，黄芩素对皮肤鳞癌细胞A431、食管癌细胞EC109等均具有抑制作用，也能降低人类骨肉瘤MG63细胞的侵袭转移能力［3-4］。本试验中研究了黄芩素对人肺癌细胞A549的增殖抑制作用及细胞周期的影响，并探讨了其作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

人肺癌细胞A549由恩施州中心医院肿瘤研究室提供。黄芩素（中国药品生物制品检定所，批号为201002，纯度不低于98.0% ），用二甲基亚砜（DMSO）配制成母液，于-20℃保存；RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT，美国Sigma公司）；Survivin及Caspase-3兔抗人多克隆抗体、免疫组织化学二抗试剂盒、胎牛血清、胰蛋白酶和DMSO（北京中杉金桥生物技术有限公司）；EphA2兔抗人多克隆抗体（Santa Cruz公司）；流式细胞术二抗（Jackson Immunoresearch Laboratiries Inc公司）。NAPCO CO2培养箱（美国 Nuair公司）；Elx酶标仪（Bio-TEK公司）；EPICS XL流式细胞仪（美国Coulter公司）。

1.2 方法

细胞培养：将人肺癌细胞A549常规培养于含10%胎牛血清、100 U／mL青霉素和0.1 g／L链霉素的RPMI 1640培养液中，置37℃及5%CO2、饱和湿度培养箱中培养24 h，传代后取对数生长期细胞用于试验。

黄芩素对细胞的生长抑制作用（MTT法）：将对数生长期人肺癌细胞A549用0.25%的胰蛋白酶消化后用RPMI 1640培养液制成1×104个／mL的细胞悬液，然后接种于96孔板，每孔100 μL，置37℃及5%CO2、饱和湿度培养箱中培养24 h，吸出培养液，加入新鲜培养液 180 μL及黄芩素20 μL。黄芩素用 DMSO溶解（DMSO终体积分数不大于0.1%），试验孔分别加入黄芩素后其终质量浓度为 1，3，10，30，100 μg ／mL，每组设 6 个复孔。同时设空白对照组和5-氟尿嘧啶（5-FU）对照组，空白对照组加入20 μL培养液，5-FU对照组加入同体积5-FU（终质量浓度为10 μg／mL）。各组分别培养 24，48，72 h 后，每孔加入 5 g／L MTT溶液20μL，继续培养4h，弃上清液，每孔加DMSO150μL，振荡溶解15min，立即用酶标仪在570nm波长处测定吸光度（A）值。细胞生长抑制率＝（1-试验组平均 A值／空白对照组平均 A值）×100%［5］。

细胞凋亡率及细胞周期的变化（流式细胞术）：根据MTT法检测结果，设置空白对照组及黄芩素3，10，30 μg／mL组。将对数生长期人肺癌细胞A549用0.25%的胰蛋白酶消化后，再用RPMI 1 640培养液制成2×104个／mL的细胞悬液，加入黄芩素培养24 h或48 h，用胰酶消化，收集细胞并用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗2次，用70%乙醇悬浮细胞沉淀，于-20℃固定24 h以上。PBS离心洗去乙醇，加入PI染液，避光染色30 min，过滤后用流式细胞仪于488 nm波长处检测DNA含量，分析细胞凋亡率和细胞周期［6］。

黄芩素对EphA2，Survivin，Caspase-3表达的影响：应用流式细胞仪，通过间接免疫荧光标记法进行蛋白含量检测。以PBS为阴性对照，以二抗为阳性对照，用同型抗体替代抗体作为同型对照。以对数方式采集数据，以样品蛋白表达的平均荧光强度表示各组蛋白的含量。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 对细胞增殖的抑制作用

黄芩素质量浓度为1～100 μg／mL时对人肺癌细胞A549的增殖有显著抑制作用，且随着质量浓度的升高抑制作用增强，随着作用时间的延长抑制作用也增强。详见表1。

2.2 对细胞周期及其凋亡率的影响

黄芩素质量浓度为3～30 μg／mL时，随着质量浓度的增加，G1／G0期DNA含量降低，S期DNA含量明显增加。以二倍体峰（G0／G1）前出现亚G1峰表示凋亡细胞峰位，根据其分布组方图计算细胞凋亡率，随着黄芩素质量浓度的增加，细胞凋亡率显著升高。详见表2和表3。

表1 黄芩素对人肺癌细胞株A549生长的影响（ ± s，n＝6）

表1 黄芩素对人肺癌细胞株A549生长的影响（ ± s，n＝6）

注：与空白对照组比较，*P＜0.01。下表同。

组别 药物质量浓度（μg ／mL）培养24 h 培养48 h 培养72 h A值A值A值空白对照组5-FU组黄芩素组-10 1 3 1 0 30 100 0.184 ± 0.009 0.133 ± 0.010*0.164 ± 0.014*0.125 ± 0.009*0.086 ± 0.012*0.069 ± 0.011*0.052 ± 0.014*抑制率（%）-27.72 10.87 32.07 53.26 62.50 71.74 0.289 ± 0.013 0.204 ± 0.009*0.251 ± 0.011*0.182 ± 0.012*0.123 ± 0.008*0.095 ± 0.010*0.079 ± 0.011*抑制率（%）-29.41 13.15 37.02 57.43 67.13 72.66 0.312 ± 0.015 0.167 ± 0.009*0.235 ± 0.011*0.169 ± 0.012*0.108 ± 0.009*0.097 ± 0.011*0.075 ± 0.013*抑制率（%）-46.47 24.68 45.83 65.38 68.91 75.96

表2 黄芩素对人肺癌细胞A549细胞周期的影响（ ± s，n＝6）

表2 黄芩素对人肺癌细胞A549细胞周期的影响（ ± s，n＝6）

组别 药物质量浓度（μg ／mL）培养24 h培养48 h S S空白对照组黄芩素组-3 10 30 G1／G0 64.71 ± 2.12 58.32 ± 1.44*54.34 ± 1.38*47.16 ± 1.62*33.34 ± 1.43 40.36 ± 1.52*44.25 ± 1.61*51.57 ± 1.42*G2／M 1.31 ± 0.26 1.43 ± 0.33 1.52 ± 0.25 1.43 ± 0.31 G1／G0 73.62 ± 1.53 63.23 ± 1.81*55.82 ± 1.76*51.10 ± 1.60*24.82 ± 1.24*35.23 ± 1.41*42.56 ± 1.53*47.34 ± 1.67*G2／M 1.61 ± 0.32 1.54 ± 0.16 1.62 ± 0.25 1.56 ± 0.19

表3 黄芩素对人肺癌细胞A549细胞凋亡率的影响（ ± s，n＝6）

表3 黄芩素对人肺癌细胞A549细胞凋亡率的影响（ ± s，n＝6）

组别空白对照组黄芩素组药物质量浓度（μg／mL）-10 20 40凋亡率（%）培养24 h 1.23 ± 0.19 3.53 ± 0.31*6.18 ± 0.62*13.12 ± 0.74*培养48 h 2.23 ± 0.42 4.76 ± 0.38*9.75 ± 0.72*16.52 ± 0.72*

2.3 对细胞EphA2，Survivin，Caspase-3蛋白表达的影响

质量浓度为3～30 μg／mL时，黄芩素显著下调 EphA2和Survivin蛋白的表达，显著上调Caspase-3蛋白的表达。见表4。

3 讨论

据世界卫生组织（WHO）统计显示，肺癌发病率及病死率均居全球癌症首位［7］。随着我国工业化速度的加快和吸烟率的增加，肺癌的发病率在我国城镇中正迅猛增长，已成为城市人口恶性肿瘤死亡的首位原因［8］。我国因癌症死亡的患者中肺癌约占20%，且发病率及病死率均迅速增长［9］。

中药在抗肿瘤方面有独特的优势，日益受到重视。黄芩素是从唇形科植物黄芩的干燥根中提取的黄酮类化合物，具有多种药理作用，已开发多种制剂而应用于临床。近年来的研究显示，黄芩素在抗肿瘤方面也具有一定作用。本研究结果显示，黄芩素质量浓度为1～100 μg／mL时，均能显著抑制肺癌细胞A549的生长。黄芩素抑制肿瘤细胞增殖作用随浓度的增加而增强，且随作用时间的延长而增强，故表现为显著的浓度和时间依赖性。

细胞本身在一定的生理或病理条件下会发生凋亡，部分抗肿瘤药物对肿瘤细胞凋亡通路有影响。有研究显示，黄芩素可引起食管癌细胞EC109细胞周期的改变及皮肤鳞癌细胞A431的凋亡［2-3］。在本试验中，人肺癌细胞A549在黄芩素质量浓度为3～30 μg／mL时，作用24 h和48 h后，采用流式细胞仪检测。结果表明，G1／G0期DNA含量降低，S期DNA含量明显增加，故细胞被阻滞在S期。细胞凋亡率随着黄芩素浓度的增加而增加。Survivin是多种肿瘤的通用抗原，高表达于所有恶性肿瘤，调节细胞分裂和抗凋亡功能［10］。Caspase-3是Caspase家族成员中执行凋亡的关键酶［6］。EphA2受体具有酪氨酸激酶活性，EphA2可高表达于多种恶性肿瘤组织［11］。本试验结果显示，随着黄芩素浓度的增加，Survivin蛋白和EphA2蛋白表达减弱，而Caspase-3蛋白表达增强。

表4 黄芩素对人肺癌细胞A549 EphA2，Survivin，Caspase-3蛋白表达的影响（ ± s，n＝6）

表4 黄芩素对人肺癌细胞A549 EphA2，Survivin，Caspase-3蛋白表达的影响（ ± s，n＝6）

组别 药物质量浓度（μg ／mL）空白对照组黄芩素组培养24 h培养48 h-3 1 0 30 EphA2 13.56 ± 1.31 9.23 ± 1.46*7.36 ± 1.52*6.24 ± 1.43*Survivin 12.65 ± 1.34 9.52 ± 1.36*7.53 ± 1.24*6.54 ± 1.58*Caspase-3 11.36 ± 1.54 16.24 ±2.53*25.46 ±3.52*34.63 ±3.24*EphA2 19.35 ± 1.59 9.75 ± 1.24*7.78 ± 0.98*6.54 ± 0.87*Survivin 18.64 ± 1.52 9.86 ± 1.74*7.83 ± 1.20*7.51 ± 1.25*Caspase-3 14.63 ± 1.52 18.52 ± 2.15*29.75 ± 2.89*37.63 ± 2.54*

黄芩素对人肺癌细胞A549的增殖具有一定抑制作用，其作用机制可能通过抑制Survivin蛋白和EphA2蛋白的表达，以及增强Caspase-3蛋白的表达，来诱导肿瘤细胞的凋亡。

参考文献：

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