卡巴胆碱联合膳食纤维对烫伤休克大鼠血浆内毒素和D-乳酸的影响

张磊　赵春香　王瑞刚　贺瑞新　冯凯　石秋艳

卡巴胆碱联合膳食纤维对烫伤休克大鼠血浆内毒素和D-乳酸的影响

张磊赵春香王瑞刚贺瑞新冯凯石秋艳

【摘要】目的初步研究卡巴胆碱联合膳食纤维对烫伤大鼠肠屏障的作用。方法以30%TBSAⅢ°烫伤Wistar大鼠为动物实验模型，随机分为0.9%氯化钠溶液组(A组)、膳食纤维治疗组(B组)、卡巴胆碱治疗组(C组)、膳食纤维+卡巴胆碱治疗组(D组)，分别在伤后6、12、24、48、72 h活杀动物，另设正常组(N组)，取小肠在光镜下观察其病理形态变化，取门静脉血测血浆微量内毒素的变化，取腹主动脉血测血浆D-乳酸的变化。结果各烫伤组大鼠肠组织受损程度，血浆内毒素、D-乳酸水平明显高于组(P＜0.05)，伤后12～24 h最显著，至72 h仍不能恢复;联合应用卡巴胆碱与膳食纤维，显著降低了血浆内毒素、D-乳酸水平(P＜0.05)。结论早期联用卡巴胆碱与膳食纤维对烫伤后大鼠肠屏障道有明显保护作用，一定程度上优于单用卡巴胆碱或膳食纤维的治疗效果。

【关键词】烫伤;血浆内毒素; D-乳酸;卡巴胆碱;大鼠

项目来源:河北省医学科学研究与发展指令性课题(编号: ZL20140187)

作者单位: 063000河北省唐山市，河北联合大学附属医院NICU

胃肠道是人体主要消化器官，也是体内最大的细菌储存器官，容纳细菌数量高达1 012个［1］。正常生理情况下，肠道有着重要的屏障作用，称之为肠屏障(intestinal barrier)，由机械屏障、化学屏障、微生物屏障和免疫屏障等组成。严重创伤、烧(烫)伤等可造成肠黏膜屏障的损伤、萎缩，肠通透性增加，肠菌群失调，造成肠屏障破坏或功能障碍，从而导致细菌和(或)内毒素易位，炎症因子释放，并可诱发和(或)加重全身炎症反应和多器官功能障碍［2，3］。随着研究及临床实践的深入，肠屏障保护越来越受到重视。本实验以30%TBSAⅢ°烫伤大鼠为动物模型，探讨研究卡巴胆碱联合膳食纤维对肠屏障的保护作用。

1　材料与方法

1.1材料清洁级成年雄性Wistar大鼠，购自中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心［合格证号: SCXK-(军) 2009-003］，称重并编号，体重为(300±20) g。复合膳食纤维购于纽迪希亚(Nutircia，荷兰)制药(无锡)有限公司，不可溶性膳食纤维(耐消化淀粉∶纤维素=1∶1)与可溶性膳食纤维(菊粉∶低聚果糖∶阿拉伯胶=1∶1∶1)的比例为3∶1，加水配成浓度为200 g/L的液体。卡巴胆碱购于美国Sigma公司。0.9%氯化钠溶液购于石家庄四药集团。1.2烫伤模型制备将大鼠随机分为正常组(N组)、0.9%氯化钠溶液组(A组)、膳食纤维治疗组(B 组)、卡巴胆碱治疗组(C组)、膳食纤维+卡巴胆碱治疗组(D组)，A、B、C、D组再分为6、12、24、48、72 h 5个时间点，每个时间点各4只大鼠。N组4只大鼠。术前12 h禁食，不禁水。用10%水合氯醛溶液(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后用6%硫化钠脱去大鼠肩部至髋部30% TBSA毛发［4］。A、B、C、D组大鼠置入97～99℃沸水25 s，制备30% TBSAⅢ°烫伤大鼠［5，6］。伤后各烫伤组立即按Parkland公式以4 ml·kg－1·1%TBSA－1的一半腹腔注射补液。伤后2 h，C、D组大鼠腹腔予以卡巴胆碱(30 μg/kg)。伤后3 h，A组开始予以0.9%氯化钠溶液灌胃，B、D组开始予以复合膳食纤维灌胃，复合膳食纤维量为每天125 ml/kg;均匀分6次给予(4 h 1次)，直至被活杀。期间5组大鼠自由饮水。

1.3检测指标

1.3.1肠道损伤情况:取距回盲部处的小肠组织体积分数为10%的中性甲醛溶液固定，常规制片，苏木素伊红染色后进行组织学检查，采用四级评分系统对小肠损伤情况进行评定(0～3分)［7］。0分:无异常改变; 0.5分:肠黏膜水肿、充血，无坏死性病变; 1分:病变局限与肠黏膜有散在性出血点; 2分:坏死累及表浅黏膜，黏膜中有多区域出血; 3分:全层坏死并伴肠腔出血。

1.3.2血浆内毒素测定:所用物品均经去热源处理。严格按无菌操作规程取门静脉血1.5 ml，5 000 r/min离心5 min取上层血清，置入－80℃冰箱保存备检。按照大鼠血浆内毒素Elisa试剂盒(购于Bio Swamp公司)使用说明书检测。

1.3.3血浆D-乳酸测定:穿刺腹主动脉，取血4～5 ml，5 000 r/min离心5 min，吸取上清液血浆，取上层血清，置入－80℃冰箱保存备检。按照大鼠血浆D-乳酸Elisa试剂盒(购于Bio Swamp公司)使用说明书检测。

2　结果

2.15组小肠病理学标本观察结果烫伤后，4组大鼠的小肠黏膜出现固有层水肿，中性粒细胞及淋巴细胞浸润，部分黏膜上皮细胞变性、坏死、脱落;肠绒毛横径增宽，高度缩短。6 h各烫伤组损伤评分无明显差异。12 h各烫伤组损伤最明显，评分最高，其中D组评分较A组差异比较明显(P＜0.05)。24 h后各烫伤组受损黏膜开始修复，但各组修复速度不等，A组评分仍高于其他烫伤组(P＜0.05)，但B、C、D组之间损伤评分差异不明显(P＞0.05)。72 h后肠黏膜损伤较前好转，损伤评分下降，但仍高于N组(P＜0.05)。见表1。

表1　5组大鼠小肠损伤评分结果　n=4，分，±s

表1　5组大鼠小肠损伤评分结果　n=4，分，±s

注:与A组比较，*P＜0.05

组别6 h　12 h　24 h　48 h　72 h N组0 A组　0.750±0.289　2.000±0.817　1.500±0.574　1.125±0.629　0.750±0.289 B组　0.625±0.250　1.250±0.500　0.750±0.289*　0.500±0.408*　0.250±0.289* C组　0.750±0.287　1.250±0.500　0.750±0.289*　0.375±0.250*　0.250±0.289* D组　0.750±0.289　1.125±0.629*　0.750±0.289*　0.375±0.250*　0.250±0.289*

2.25组大鼠内毒素测定结果烫伤后，各烫伤组血浆内毒素水平变化趋势一致，且各时间点均与正常组有非常显著差异(P＜0.01)。6 h后各烫伤组内毒素水平已较N组有明显差异性(P＜0.01)，但各烫伤组间差异性不大(P＞0.05)。12 h后各烫伤组血浆内毒素水平较前升高，其中D组血浆内毒素水平低于A组，差异有统计学意义(P＜0.05) ; B、C组与A组相比，差异性不明显(P＞0.05)。24 h后各烫伤组血浆内毒素水平升至最高水平，但B、C、D组内毒素水平均低于A组，差异有统计学意义(P＜0.01) ; B、C组内毒素水平均高于D组，且差异有统计学意义(P＜0.05)。48 h后各烫伤组血浆内毒素水平较24 h后有明显下降，但A组内毒素水平仍高于其他烫伤组，D组与A组差异有统计学意义(P＜0.05) ; B组与C组无明显差异(P＞0.05)。72 h后各烫伤组内毒素水平降至最低水平，但仍高于N组(P＜0.05) ; B、C、D组内毒素水平均低于A组(P＜0.05或＜0.01) ;另外D组水平明显低于B、C组(P＜0.05或＜0.01)。见表2。

表2　5组大鼠内毒素水平比较　n=4，EU/L±s

表2　5组大鼠内毒素水平比较　n=4，EU/L±s

注:与N组比较，*P＜0.01;与A组比较，#P＜0.05，△P＜0.01;与B组比较，☆P＜0.05;与C组比较，▲P＜0.05

组别6 h　12 h　24 h　48 h　72 h N组0.028±0.011 A组　0.091±0.009*　0.534±0.016*　0.706±0.083*　0.368±0.104*　0.136±0.021*# B组　0.098±0.021*　0.518±0.024*　0.602±0.033* #　0.276±0.028* #　0.107±0.019* #C组　0.086±0.007*　0.511±0.026*　0.599±0.028* #　0.266±0.013* #　0.110±0.008* #D组　0.093±0.018*　0.493±0.021* #　0.516±0.032＊△☆▲　0.226±0.020＊△☆▲　0.073±0.020＊△☆▲

2.35组大鼠血浆D-乳酸测定结果血浆D-乳酸含量在烫伤后各时间点与N组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，烫伤6 h后4组大鼠血浆D-乳酸水平已明显高于正常组(P＜0.05)，12 h后达到峰值，24 h后较前下降，72 h后降至最低。4组随时间的变化趋势一致。烫伤6h后4组大鼠之间血浆D-乳酸水平差异不明显(P＞0.05)。12 h后4组比较，D组D-乳酸水平明显低于A组(P＜0.05)，但A、B、C组之间无明显差异(P＞0.05)。24 h后D组血浆D-乳酸水平与B组或C组相比差异有统计学意义(P＜0.01)。 48 h后D组血浆D-乳酸水平明显低于B组(P＜0.05)，但与C组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。72 h后B、C、D组D-乳酸水平均低于A组(P＜0.01)。见表3。

表3　5组大鼠血浆D-乳酸水平比较　n=4，μg/L，±s

表3　5组大鼠血浆D-乳酸水平比较　n=4，μg/L，±s

注:与N组比较，*P＜0.05;与A组比较，#P＜0.05，△P＜0.01;与B组比较，☆P＜0.05，▲P＜0.01;与C组比较，★P＜0.01

组别6 h　12 h　24 h　48 h　72 h N组22.210±5.088 A组　111.863±20.191*　162.108±11.601*　131.567±8.124*　88.218±4.959*　70.485±6.730*B组　119.745±19.406*　148.316±17.476*　123.686±4.959*　80.337±10.364*　51.766±3.218＊△C组　120.730±10.426*　139.449±25.208*　122.700±8.513*　78.366±13.021*　51.766±3.218＊△D组　103.982±15.557*　134.523±8.513* #　103.982±13.412＊△▲★　64.574±13.021＊△☆　46.840±3.773＊△

3　讨论

肠缺血-再灌流是烧(创)伤后最常见的病理生理过程。肠上皮细胞是肠屏障的重要组成部分，对缺血、缺氧十分敏感。缺血、缺氧可引起肠上皮细胞结构、功能的改变，导致肠屏障功能障碍，引起细菌和内毒素的移位，与脓毒症和MODS的发生有密切关系，是机体遭受“二次打击”的来源［8，9］。这一观点已经被绝大多数同业人员所接受。如何减轻机体创伤后肠屏障的损害，减少细菌和内毒素移位，一直是关于防治脓毒症和MODS研究的重要课题。

膳食纤维［10，11］是指能抗人体小肠消化吸收而能在大肠部分或全部发酵可食用植物性成分、碳水化合物及其相类似物质总称。早期研究证实，膳食纤维是消化过程中所需要的重要营养素，能够促进肠蠕动，抑制肠道细菌的生长，调节肠道菌群的生态平衡，有助于维护肠黏膜结构的完整性，降低肠道通透性，对肠黏膜有明显营养和保护作用［12］。

卡巴胆碱(Carbachol)是一种胆碱能受体激动药，能同时兴奋胆碱能M受体和N受体，其兴奋M受体可促进胃肠动力，扩张血管;兴奋N受体与胆碱能抗炎通路有关。相关研究表明，卡巴胆碱既能改善肠道微循环，扩张血管增加肠黏膜血流量，又能够显著降低肠缺血-再灌注损伤后肠组织炎性反应，减少炎性因子释放，减轻肠缺血-再灌注时肠上皮细胞的损害，从而起到保护肠屏障功能［13］。

我们设计本实验以研究在烧伤早期联合应用复合膳食纤维与卡巴胆碱对肠屏障的保护作用，并比较联合应用的治疗效果与单独应用卡巴胆碱或膳食纤维时的治疗效果。本实验以30%TBSAⅢ°烫伤Wistar大鼠为动物模型。目前检测肠屏障损伤的指标有多种，在本实验中我们选择的是光镜下的肠结构变化和血浆内毒素、D-乳酸的水平变化，其中以血浆内毒素变化敏感性最高。

实验结果显示，在烫伤早期，各烫伤组大鼠肠损伤评分、血浆内毒素、D-乳酸水平均较正常组大鼠显著升高，提示30% TBSAⅢ°烫伤导致大鼠肠道屏障受损［14］。以肠损伤评分作为参考来比较，烫伤12 h后，卡巴胆碱与膳食纤维联用时，肠损伤评分低于对照组，表现出对肠道的保护，而单用卡巴胆碱或膳食纤维未表现出保护作用，表明二者联用对肠屏障保护启动时间较早;但在24 h后各时间点比较，单用卡巴胆碱或膳食纤维与二者联用均对肠道有保护作用，3组差别不明显。以血浆内毒素水平作为参考来看，卡巴胆碱联合膳食纤维在烫伤12 h后已表现出对肠屏障的保护;烫伤24 h以后，单用或者联合应用均对肠屏障有明显保护作用，但从B、C、D组内毒素水平差异来看，卡巴胆碱联合膳食纤维对肠道的保护要优于单用卡巴胆碱或膳食纤维。从各组D-乳酸水平变化来看，亦可看出卡巴胆碱联合膳食纤维对肠道的保护启动较快，在12 h后即表现出对肠道的保护作用;烫伤24 h后卡巴胆碱联合膳食纤维对肠道保护作用强于单用卡巴胆碱或膳食纤维，但在创伤后期各治疗组之间无明显区别。由此可见，早期联合应用卡巴胆碱与膳食纤维对烫伤后大鼠肠屏障道有明显保护作用，启动时间较早，优于单用卡巴胆碱或膳食纤维的治疗效果。

经文献检索发现，国内外尚未见有与本研究相似的研究报告。本研究仅是初步的，存在样本量小等问题，仍须做进一步的动物试验和临床研究探讨。

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Effect of carbachol combined with dietary fiber on the levels of plasma endotoxin and D-lactic acid in rats with scald

ZHANG Lei，ZHAO Chunxiang，WANG Ruigang，et al.
Hebei United University，Hebei，Tangshan 063000，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate initially the effect of carbachol combined with dietary fiber on the intestinal barrier in rats with scald.Methods The animal models were established in Wistar rats by 30% TBSAⅢ°scald，and the model rats were randomly divided into four groups: physiological saline group (Group A)，dietary fiber treatment group (Group B)，carbachol treatment group (Group C)，carbachol plus dietary fiber treatment group (Group D).Meanwhile normal control group was set up.These rats were sacrificed at 6，12，24，48 and 72 hours after scald.The pathological changes in small intestine were observed under light microscope，and portal vein blood specimens were taken to detect the levels of plasma endotoxin，and abdominal aorta blood specimens were taken to detect the contents of plasma D-lactic acid.Results The injury degree in small intestine，the plasma levels of endotoxin and D-lactic acid in scald groups were significantly higher than those in normal control group (P＜0.05)，which peaked at 12～24h after scald，moreover，which could not recover to normal levels until 72 hours after the injury.The combined application of carbachol with dietary fiber could obviously decrease the plasma levels of endotoxin and D-lactic acid (P＜0.05).ConclusionEarly combined application of carbachol with dietary fiber has obvious protective effects on intestinal barrier in rats with scald，which is superior to simple application of carbachol or dietary fiber.

【Key words】scald; endotoxin; plasma D-lactic acid; carbachol; rats

(收稿日期:2014－10－17)

通讯作者:王瑞刚，063000河北联合大学附属医院NICU; E-mail: wangrg123@ tom.com

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.08.001

【文章编号】1002－7386(2015) 08－1125－04

【文献标识码】A

【中图分类号】R 644