dlx基因在中国首例ADULT综合征患者发病中的作用

王霞，杨健，杨文林，熊春萍(广州医科大学附属第一医院，广州500;广州医科大学附属第二医院)

dlx基因在中国首例ADULT综合征患者发病中的作用

王霞1，杨健2，杨文林2，熊春萍1
(1广州医科大学附属第一医院，广州510120;2广州医科大学附属第二医院)

摘要:目的探讨dlx基因与ADULT综合征发生的关系。方法对中国首例ADULT综合征患者及其4代家系共17例成员的dlx基因家族进行PCR扩增并测序，观察ADULT综合征家系中dlx基因家族成员的遗传学改变。结果在患者及其父系家族5例成员(包括患者父亲)的dlx3基因第2内含子发现1个相同的单核苷酸多态性(cSNP)位点cSNP(A/G) rs760088，而母系家族成员未发现cSNP(A/G) rs760088，父系cSNP(A/G) rs760088发生率高于母系(P=0.034)。结论ADULT综合征的发病可能与dlx3基因有关，而且患者与其父系家族成员可能存在更多的遗传相关性。

关键词:遗传性疾病，先天性; ADULT综合征; dlx基因;单核苷酸多态性

ADULT综合征是一种典型的外胚层发育异常综合征，属于常染色体显性遗传［1，2］。2010年我们发现了国内首例ADULT综合征家系，并观察到ADULT综合征患者p63基因的第8外显子发生了错义突变(R298Q)［3～6］。ADULT综合征的临床表现有四肢发育畸形、神经性皮炎改变(包括指趾剥脱性皮炎)、皮肤干燥、乳腺和乳头发育不全或缺失、缺指(趾)畸形和并指症、指(趾)甲发育异常、泪管闭锁、少汗、牙齿发育不全等症状。由于p63基因在胚胎发育(特别是在四肢和其他外胚层衍生器官的发育)中起着重要作用。近年来研究发现，dlx基因家族和p63基因在调控外胚层发育中可能归属于相同的信号传导通路。dlx基因家族包括6个成员，并分为3组(dlx1/dlx2、dlx3/dlx4、dlx5/dlx6)，该基因家族在哺乳动物的外胚层(包括表皮、肢体、生殖器、腮腺、牙齿和毛发等)发育、神经发育、红细胞的生成及胎盘的发育中都起着重要的作用。新的研究证实p63基因的异构体TAp63调控dlx基因家族中的dlx3基因的表达。ΔNp63转录调控dlx5/dlx6基因，而p63基因的错义突变与dlx5/dlx6部分功能的缺失可导致严重的肢体发育畸形［9］。以上研究提示p63可能通过调控dlx基因的表达在外胚层发育不良中发挥重要作用［7～9］。2011年11月～2013年6月，我们在前期研究的基础上，进一步探讨我国首例ADULT综合征家系中dlx基因的遗传学改变及dlx基因与ADULT综合征发生的关系。

1　资料与方法

1.1临床资料以中国首例ADULT综合征患者及其4代家系(见图1)成员共17例为观察组，男10例、女7例，年龄18～72岁，中位年龄36岁。ADULT综合征患者为女性，29岁。主要临床表现:毛发稀少，唇系带和舌下系带发育不良，右手并指，颜面部大量雀斑，少汗，汗毛稀少，溢泪，左眼泪道闭锁、右眼泪道狭窄，牙齿发育不全;符合ADULT综合征的临床诊断标准［10］。患者及其姑姑、姐姐乳腺和乳头发育不良，患者及其父系家族成员躯干部位长有散在小片萎缩斑，男性较明显。患者母系家族成员未发现与ADULT综合征相关的体征。另取正常人30例为对照组，男14例、女36例，年龄16～75岁，中位年龄41.5岁;个体之间无血缘关系。各研究对象及其家属对本研究均知情同意。

1.2dlx基因检测检测材料包括人外周血DNA提取试剂盒(MACHEREY-NAGEL，Germany)、PCR扩增试剂(Promega，USA)、引物序列设计(PrimerPrimer5.0)、引物合成(上海生工生物工程技术有限公司)、琼脂糖(GENE，USA)、6×Loading Buffer(宝生物工程有限公司)、溴化乙锭(储存液10 mg/mL、工作液0.5 mg/mL，广州威佳生物技术公司)、DNA Marker(2 000 bp，宝生物工程有限公司)、SYBR Green荧光染料等(GENE，USA)、PCR产物回收纯化试剂盒及质粒抽提试剂盒(QIAGEN，Germany)。具体检测方法如下:①人外周血DNA的提取:采用人外周血DNA提取试剂盒，严格按照说明书操作。提取的DNA分装5个1.5 mL EP管，－20℃保存。②引物设计:根据Zhou等［11］方法原理，应用Primer Premier 5.0软件设计引物并委托上海英骏生物技术有限公司合成。dlx3基因引物序列:第1外显子的上游引物为: 3'-ACGGTGAACCCCTACACCTA-5'，下游引物为: 3'-TCTTGGGCTTCCCATTCACC-5';第2外显子的上游引物为: 3'-TCCTTCGATCGCAAGCTCAG-5'，下游引物为: 3'-TGGTGGTAGGTGTAGGGGTT-5';第3外显子的上游引物为: 3'-TACCTACGGAGCCTCCTACC-5'，下游引物为: 3'-ACTCAGGTTCTGTGCGTGAT-5'。③PCR扩增:取人外周血DNA 95℃变性5 min，95℃30 s，根据1～3外显子选择不同退火温度，30 s，72℃1 min，35个循环;延伸72℃5 min，扩增产物4℃保存。④PCR产物电泳、判定:取琼脂糖0.6 g加入40 mL 0.5×TBE液中，微波炉加热2 min，冷却至50℃左右，加入1.5% EB液1.5 mL，胶倒置胶槽中。分别取PCR产物5 μL、6×Loading Buffer 0.5 μL，混匀，加样于1.5%琼脂糖凝胶的加样孔中。室温下恒压(120 V)电泳30 min。然后置于紫外反射投影仪上检测PCR扩增产物。在紫外线灯下切取PCR目的条带装入1.5 mL EP管;每10 mg胶加入10 μL Membrance Binding Solution混匀，水浴50～65℃，使胶完全融化，其间不停混匀;收集管插入SV柱，把样品加到SV柱上，室温1 min;16 000 g离心1 min，倒掉收集管剩余液体;加入700 μL Membrance Wash Solution，16 000 g离心1 min，倒掉收集管中液体;加入500 μL Membrance Wash Solution，16 000 g离心5 min;倒掉收集管中液体，离心1 min;把SV柱放入1.5 mL EP管内; 在SV柱中央加入50 μL Nuclease-Free Water，室温1 min，16 000 g离心1 min;回收产物，－20℃保存。确认目的片段后，将切胶回收，PCR产物送往英骏生物技术有限公司进行测序，分析突变位点。

1.3统计学方法采用SPSS19.0统计软件。父系与母系之间单核苷酸多态性(cSNP)位点发生率比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

观察组中患者及其父系家族5例成员(Ⅱ: 1，3，4，Ⅲ: 8，11)的dlx3基因第2内含子发现1个相同的cSNP位点cSNP(A/G) rs760088，而母系成员未发现该cSNP(A/G) rs760088;父系家族与母系家族cSNP(A/G) rs760088发生率比较有统计学差异(P=0.034)。对照组中未发现该cSNP (A/G) rs760088。两组rs760088测序见图2。

3　讨论

ADULT综合征由Propping等［2］在1993年首次报告并命名，其主要临床表现有四肢发育畸形、神经性皮炎改变(包括指趾剥脱性皮炎)、皮肤干燥、乳腺和乳头发育不全或缺失、缺指(趾)畸形和并指症、指(趾)甲发育异常、泪管闭锁、少汗、牙齿发育不全等症状［5］。p63基因在胚胎发育(特别是在四肢和其他外胚层衍生器官的发育)中起重要作用［6］。dlx基因家族包括6个成员，并分为3组(dlx1/dlx2、dlx3/dlx4、dlx5/dlx6)，该基因家族在哺乳动物的外胚层(包括表皮、肢体、生殖器、腮腺、牙齿和毛发等)发育、神经发育、红细胞生成及胎盘发育中都起着重要作用［7］。研究证实p63基因的异构体TAp63调控dlx基因家族中dlx3基因表达［8］。ΔNp63转录调控dlx5/dlx6基因，而p63基因的错义突变与dlx5/dlx6部分功能的缺失可导致严重的肢体发育畸形［9］。dlx基因家族是一类重要的调控外胚间充质细胞分化的转录因子，具有决定细胞命运，维持组织发育的功能［12］。dlx基因在各种发育位置均有表达，特别是在上皮间充质细胞相互作用的区域(鳃弓、胚芽、前脑、听囊、嗅囊、牙、毛囊)。Fujimoto等［13］发现dlx3基因、p63基因与外胚层发育不良有直接的相关性。尤其是毛囊、牙齿、表皮等的发育与dlx3基因关系更为密切。

在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。总的来说，位于编码区内的cSNP比较少，其变异率仅为周围序列的1/5，在遗传性疾病研究中却具有重要意义，因此cSNP的研究更受关注［14］。大多数疾病属于由遗传因素与环境因素共同作用所致的复杂疾病。SNP在医学遗传学方面，不仅可用于寻找致病基因，还可用于诊断疾病，尤其是单基因遗传病［15］。寻找和研究SNP已成为人类基因组计划的主要内容和目标。发现这些与常见疾病相关的DNA序列上的多态位点，是了解引起人类疾病复杂原因最重要的途径之一。

本研究DNA产物测序分析结果显示患者及其父系家族5名成员的dlx3基因第2内含子发现1个cSNP(A/G) rs760088，而母系成员未发现该位点。因此认为该例ADULT综合征患者的发病与父系家族有更多的遗传学相关性。

参考文献:

［1］Berk DR，Armstrong NL，Shinawi M，et al.ADULT syndrome due to an R243W mutation in TP63［J］.Int J Dermatol，2012，51 (6) : 693-696.

［2］Propping P，Zerres K.ADULT-syndrome: an autosomal-dominant disorder with pigment anomalies，ectrodactyly，nail dysplasia，and hypodontia［J］.Am J Med Genet，1993，45(5) : 642-648.

［3］Yang A，Kaghad M，Wang Y，et al.p63，a p53 homolog at 3q27 ～29，encodes multiple products with transactivating，death inducing，and dominant negative activities［J］.Mol Cell，1998，2(3) : 305-316.

［4］Wang X，Yang J，Tao AL，et al.Mutation analysis of p63 gene in the first Chinese family with ADULT syndrome［J］.Chin Med J (Engl)，2009，122(16) : 1867-1871.

［5］Rinne T，Hamel B，van Bokhoven H，et al.Pattern of p63 mutations and their phenotypes-update［J］.Am J Med Genet A，2006，140(13) : 1396-1406.

［6］Parsa R，Yang A，McKeon F，et al.Association of p63 with proliferative potential in normal and neoplastic human keratinocytes ［J］.J Invest Dermatol，1999，113(6) : 1099-1105.

［7］Morasso MI，Radoja N.Dlx genes，p63，and ectodermal dysplasias［J］.Birth Defects Res C Embryo Today，2005，75(3) : 163-171.

［8］Radoja N，Guerrini L，Lo lacono N，et al.Homeobox gene Dlx3 is regulated by p63 during ectoderm development: relevance in the pathogenesis of ectodermal dysplasias［J］.Development，2007，134(1) : 13-18.

［9］Lo lacono N，Mantero S，Chiarelli A，et al.Regulation of Dlx5 and Dlx6 gene expression by p63 is involved in EEC and SHFM congenital limb defects［J］.Development，2008，135(7) : 1377-1388.

［10］Priolo M，Silengo M，Lerone M，et al.Ectodermal dysplasias: not only skin deep［J］.Clin Genet，2000，58(6) : 415-430.

［11］Zhou Y，Guo ZJ，Han L，et al.Optimization of chloroplast microsatellite PCR conditions and primer screening for endangered Rheum officinale，Rheum palmatum，and Rheum tanguticum［J］.Genet Mol Res，2014，13(3) : 5787-5794.

［12］MacDonald RB，Pollack JN，Debiais-Thibaud M，et al.The ascl1a and dlx genes have a regulatory role in the development of GABAergic interneurons in the zebrafish diencephalon［J］.Dev Biol，2013，381(1) : 276-285.

［13］Fujimoto S，Oisi Y，Kuraku S，et al.Non-parsimonious evolution of hagfish Dlx genes［J］.BMC Evol Biol，2013，19(13) : 15.

［14］Irizarry K，Hu G，Wong ML，et al.Single nucleotide polymorphism identification in candidate gene systems of obesity［J］.Pharmacogenomics J，2001，1(3) : 193-203.

［15］Saunders CL，Crockford GP，Bishop DT，et al.Using single nucleotide polymorphisms to investigate association between a candidate gene and disease［J］.Genet Epidemiol，2001，21(Suppl 1) : 415-420.

(收稿日期2014-12-25)

基金项目:广州医科大学科研基金课题(2011A10)。

文章编号:1002-266X(2015)21-0032-03

文献标志码:B

中图分类号:R596

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.012