EGCG对人脑胶质瘤U251细胞SHP1表达的影响

吴炳山，程宏伟，王卫红，李志范，谢玉环，何昊沅，杨露露，董浩(安徽医科大学第一附属医院，合肥230032)

EGCG对人脑胶质瘤U251细胞SHP1表达的影响

吴炳山，程宏伟，王卫红，李志范，谢玉环，何昊沅，杨露露，董浩
(安徽医科大学第一附属医院，合肥230032)

摘要:目的观察表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)处理后人脑胶质瘤U251细胞SHP1表达及其启动子区甲基化情况的变化，并探讨其对U251细胞增殖的影响及机制。方法以不同浓度的EGCG处理对数生长期的U251细胞，采用CCK-8法检测细胞增殖变化，RT-PCR及Western blotting法检测U251细胞SHP1基因及蛋白表达，MSP法检测EGCG处理后SHP1启动子区甲基化。结果经不同浓度EGCG处理后，U251细胞增殖被抑制，EGCG的抑制作用呈浓度依赖性; U251细胞中SHP1 mRNA的相对表达量及蛋白表达水平明显升高; SHP1启动子区的甲基化水平发生了翻转，由高甲基化转变为低甲基化。结论EGCG可能通过引起人脑胶质瘤U251细胞SHP1启动子区去甲基化使SHP1表达增加，从而抑制细胞增殖。

关键词:胶质母细胞瘤;表没食子儿茶素没食子酸酯;细胞增殖;蛋白酪氨酸磷酸酶; DNA甲基化

胶质母瘤是最常见的并最有侵袭性的恶性原发脑肿瘤，恶性程度高，治疗效果差，对人类健康危害极大［1，2］。多酚是一类提取于蔬菜水果的化合物的统称，除了具有抗氧化作用，还具有较强的抗肿瘤活性。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是一种常见多酚，在绿茶中含量很高;研究发现，EGCG能抑制胶质瘤细胞增殖并促进其凋亡，但作用机制目前尚不清楚［3］。SHP1是蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的重要成员，与肿瘤发生密切相关［4］。2014年7 ～12月，我们使用EGCG处理胶质瘤U251细胞，检测其SHP1的表达及其启动子区甲基化情况的变化，进一步探讨其对U251细胞增殖的影响及其机制。

1　材料与方法

1.1材料U251细胞购自协和医科大学基础医学研究所细胞中心，细胞培养基及胎牛血清(FBS)购自Gibco公司，EGCG购自Sigma-Aldrich公司，PCR试剂购自TAKaRa公司，Cell Counting Kit-8购自Dojindo公司，Rabbit anti-SHP1 Antibody购自CST公司，Goat anti-Rabbit HRP-IgG(H+ L) Antibody购自中杉金桥公司，引物合成由Invitrogen公司完成，基因测序由上海生工公司完成。

1.2U251细胞培养U251细胞用含有10% FBS的高糖DMEM培养基培养，酌情加入或不加入青霉素、链霉素，置于37℃含5% CO2的恒温培养箱，培养70%～80%时传代。吸去培养基，用37℃预热的PBS洗1次，弃去PBS，加入预热的0.25%的胰蛋白酶(直径10 cm平皿加入约1 mL)消化约2 min，并在倒置显微镜下观察。不时摇动培养瓶，至细胞基本回缩变圆，轻轻拍打培养瓶，使细胞与底脱离，加入适量预热新鲜全培养基中和胰酶，小心吹打使细胞与壁脱离，防止聚集成团。细胞以1 000 r/min离心5 min，重悬，可直接根据经验按1∶5～1∶3传代，或计数后按实验需要传代。每周约传代两次，保持细胞处于对数生长状态。传代后的细胞置于培养箱继续培养。

1.3EGCG处理U251细胞EGCG 50 mmol/L溶于无菌水中，－20℃保存，使用前解冻，原则上不反复冻融。处理前1 d细胞计数传代，24 h后细胞生长70%～80%汇合。按需要浓度取相应量EGCG，加入到预热后的新鲜全培养基中，反复吹打使之充分溶解。吸除培养板内的陈旧培养基，加入含有药物的培养基，置于培养箱培养到指定时间，收集细胞备用。

1.4U251细胞增殖抑制测定采用CCK-8法。在96孔板中配制100 μL的细胞悬液，每孔加入5 ×103～1×104个细胞，设5个复孔，将培养板在培养箱预培养24 h。更换新鲜培养基，向培养板中加入含EGCG不同浓度(0、12.5、25、50、100、200 μmol/L)的培养基，将培养板在培养箱孵育24 h，向每孔加入10 μL CCK-8溶液。将培养板在培养箱内孵育2 h，用酶标仪测定在波长450 nm处的吸光度，得出EGCG不同浓度处理后U251细胞存活率，并作出细胞增殖抑制曲线。

1.5U251细胞SHP1基因表达检测采用RTPCR法。将细胞样品使用Total RNA KitⅠ提取细胞RNA，紫外分光光度测定仪测定RNA样品在波长260、280 nm处的吸光度A260和A280，根据A260/A280比值，估测RNA质量。用TaKaRa公司PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit将提取的细胞RNA反转录为cDNA，用TaKaRa公司Premix Ex TaqTMVersion 2.0 (Loading dye mix)以反转录的cDNA为模板扩增，测定SHP1基因相对表达量。

1.6U251细胞SHP1蛋白表达检测采用Western blotting法。将细胞样品裂解，提取细胞总蛋白(裂解液中加入Halt蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)，测定蛋白浓度。蛋白样品行SDS-PAGE电泳，而后转至PVDF膜上，封闭，分别加入一抗和二抗孵育，洗膜后发光显影，使用凝胶成像系统分析结果。

1.7EGCG处理后SHP1启动子区甲基化检测采用MSP法。使用TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit提取基因组，提取得到的基因组DNA通过吸光度测定后定量，而后将DNA用NaOH及对苯二酚处理后加入亚硫酸氢钠避光水浴进行修饰并纯化，最后行PCR扩增及核酸电泳。

1.8统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计量资料用珋x±s表示，并进行正态性及方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1EGCG对U251细胞增殖的抑制作用不同浓度(0、12.5、25、50、100、200 μmol/L) EGCG处理U251细胞24 h后细胞增殖抑制情况见图1。U251细胞经12.5 μmol/L EGCG处理后对其增殖无明显影响，而经25 μmol/L及以上浓度的EGCG处理后，增殖明显抑制。即随着EGCG浓度的增高，对细胞增殖的抑制作用增强，EGCG对U251细胞增殖的抑制呈浓度依赖性(P＜0.05)。

2.2EGCG处理后U251细胞中SHP1基因及蛋白表达经0、40、80 μmol/L的EGCG处理后U251细胞中SHP1 mRNA的相对表达量分别为1.00± 0.00、2.48±0.11、4.34±0.19，三者比较差异有统计学意义(P＜0.05)。不同浓度EGCG处理后U251细胞中SHP1蛋白表达差异有统计学意义(P ＜0.05)。见图2。

2.3EGCG处理后U251细胞SHP1启动子区的去甲基化状态经DNA甲基转移酶(DNMT) DAC处理证实在U251细胞中SHP1启动子区高度甲基化;经40 μmol/L EGCG处理后U251细胞的SHP1启动子的甲基化水平发生了翻转，即由高甲基化转变为低甲基化，在凝胶电泳上表示为甲基化条带消失，证实EGCG 对SHP1启动子区甲基化状态的翻转作用。见图3。

3　讨论

对肿瘤来说，DNA甲基化是一种保持基因长期沉默的手段;通常情况下，DNA甲基化状态应受到严格控制。但在一些特殊情况下，DNA甲基化的状态可能发生变异，由此对基因表达的调控就有所松动，这是肿瘤发生的遗传基础。抑癌基因启动子区的高度甲基化和全基因组的低甲基化促进了肿瘤基因表达的沉默和整个基因组状态的不稳定［5］。全基因组低甲基化与癌细胞染色质重构和核异常息息相关，引发了染色体的不稳定。不过，DNA甲基化状态是可以改变的。表观遗传调控有关的治疗可使DNA甲基化的状态恢复正常，并防止细胞继续发生甲基化，从而使一些基因的表达沉默。使用去甲基化药物可以控制细胞的增殖、分化、调亡以及其他内环境状态。抑制DNMT活性是降低DNA甲基化最有效的一种方法［6，7］。DNA甲基化抑制剂有两大类，一类是拟核苷剂［8，9］，一类是非拟核苷剂。有研究将DNA甲基化抑制剂和组蛋白去乙酰化抑制剂结合起来，发现二者在抑制肿瘤的基因表达和生长方面有协同作用［10］。

EGCG是绿茶中最为常见的活性成分，其能够通过多种途径抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。本研究证实EGCG能够抑制U251细胞的增殖，并且这一抑制作用随着EGCG浓度增大而增强。有研究报道，EGCG能够引起多种肿瘤细胞的周期停滞［3］，但至于是引起G1期还是G2/M期停滞，依据细胞不同而不同，较低浓度的EGCG即能引起细胞周期停滞［3］。另外，G2/M期停滞可以引起细胞调亡，起到抑制肿瘤的作用。研究发现，在人类胶质瘤组织中SHP1因为启动子区高度甲基化而表达被沉默，并且发现SHP1启动子区甲基化水平与胶质瘤的恶性程度密切相关［4］。本研究发现，EGCG能够使胶质母细胞瘤的SHP1启动子序列内的CpG岛去甲基化，并从转录水平提高SHP1的表达。事实上，SHP1确实能够通过启动子区去甲基化的改变而调节表达［11］。当胶质母细胞瘤细胞中SHP1表达升高，细胞增殖受到抑制。因此，EGCG引起SHP1的表达升高可能会在胶质瘤细胞凋亡中起作用。由此推测，EGCG是通过表观遗传调节作用，使SHP1启动子区去甲基化调节其表达，从而起到抑制胶质瘤细胞增殖的作用。另外，异常的DNA甲基化状态也有可能由组蛋白修饰状态所调节，特别是组蛋白赖氨酸的乙酰化。EGCG能够抑制CBP/p300，从而通过抑制组蛋白乙酰化转移酶削弱组蛋白的乙酰化状态。

综上所述，EGCG可能通过引起人脑胶质瘤U251细胞SHP1启动子区去甲基化使SHP1的表达增加，从而抑制U251细胞增殖。此为表观遗传途径治疗胶质瘤提供了依据，也为SHP1作为胶质瘤的治疗靶点提供了线索。

参考文献:

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·基础研究·

Influence of EGCG on SHP1 expression in human glioblastoma U251 cell line

WU Bing-shan，CHENG Hong-wei，WANG Wei-hong，LI Zhi-fan，XIE Yu-huan，HE Hao-yuan，YANG Lu-lu，DONG Hao
(The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230032，China)

Abstract:Objective To observe the SHP1 expression changes and methylation in the promoter region of human glioblastoma U251 cell line after the treatment of Epigallocatechin Gallate(EGCG)，and to investigate the effect and mechanism of EGCG on the cell proliferation of U251 cell line.Methods U251 cells in the logarithmic phase were treated by different concentrations of EGCG.The cell proliferation was detected by CCK-8.The SHP1 gene and protein expression of U251 cells was evaluated by RT-PCR or Western blotting.MSP was used to testify methylation in the promoter region of SHP1 after EGCG treatment.Results After the treatment of different concentrations of EGCG，the proliferation of U251 cell was inhibited，and the inhibitory effect was in a concentration-dependent manner.The SHP1 mRNA and protein expression was elevated in U251 cells，and the promoter methylation of SHP1 was reversed from hypermethylation to hypomethylation.Conclusions EGCG may increase SHP1 expression by causing the methylation in the promoter region of SHP1 of the human glioblastoma U251 cell line，and thus inhibit the proliferation of U251 cell.

Key words:glioblastoma; Epigallocatechin Gallate; cell proliferation; protein tyrosine phosphatase; DNA methylation

(收稿日期:2015-03-12)

通信作者简介:程宏伟(1975-)，男，主任医师，研究方向为脑部肿瘤的发病机制及临床治疗。E-mail: chw001@163.com

作者简介:第一吴炳山(1985-)，男，主治医师，研究方向为胶质瘤发病机制及临床治疗。E-mail: wubingshan@ gmail.com

文章编号:1002-266X(2015)21-0020-04

文献标志码:A

中图分类号:R739.41

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.007