牛磺酸对小鼠肝纤维化的抑制作用

刘鸿，高元智，田菁菁，王学良，白剑(辽宁中医药大学，沈阳00;辽宁医学院附属第三医院;沈阳04医院)

牛磺酸对小鼠肝纤维化的抑制作用

刘鸿1，高元智2，田菁菁3，王学良1，白剑1
(1辽宁中医药大学，沈阳110032;2辽宁医学院附属第三医院;3沈阳204医院)

摘要:目的观察四氯化碳诱导肝纤维化小鼠牛磺酸处理前后肝损伤、纤维化、氧化应激及炎症反应指标的变化，探讨牛磺酸对小鼠肝纤维化的抑制作用。方法将30只小鼠随机分为空白对照组(腹腔注射橄榄油)、模型组和牛磺酸处理组各10只，后两组腹腔注射四氯化碳诱导小鼠肝纤维化，牛磺酸处理组造模的同时在饮水中添加牛磺酸。第10周注射结束后，检测各组小鼠血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、ALT、AST、IL-2、IL-6及肝脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA) ;计算肝脏指数; HE和Masson染色法观察肝脏组织病理学变化。结果与模型组比较，牛磺酸处理组小鼠血清中HA、LN、ALT、AST、IL-2及IL-6水平降低(P均＜0.05)，肝脏组织中SOD水平升高、MDA水平降低，肝脏指数降低(P均＜0.05)。病理检查结果显示，牛磺酸处理组肝脏组织中的炎性浸润和脂肪空泡显著减少，无纤维组织沉积。结论牛磺酸对小鼠肝纤维化具有一定的抑制作用。

关键词:肝纤维化，小鼠;牛磺酸;透明质酸;层黏连蛋白;超氧化物歧化酶;丙二醛;白细胞介素2;白细胞介素6

肝纤维化是肝细胞受到损伤或发生坏死后的常见反应，其主要的病理变化是细胞外基质(ECM)合成增多，降解相对不足，ECM在肝内过多沉积［1］。牛磺酸是人类和大多数动物体内的一种条件性必需氨基酸，对机体具有生理、营养和药理作用［2］。研究发现，对乙酰氨基酚制备的大鼠肝损伤模型经牛磺酸处理后，肝细胞内酶释放减少，肝细胞凋亡和坏死减轻，肝脏损伤得到明显改善［3］。2014年9～12月，本研究就牛磺酸对四氯化碳诱导小鼠肝纤维化的抑制作用进行了观察。

1　材料与方法

1.1实验动物纯系、雄性SPF级C57 BL/6小鼠30只，购自辽宁长生生物制品有限公司，体质量(20 ±2) g。

1.2主要试剂牛磺酸(纯度≥99% )购自北京嘉康源化工有限公司;四氯化碳(分析纯)购自沈阳宝泰克有限公司;橄榄油购自Sigma公司; ELISA法检测试剂盒购自上海劲马实验设备有限公司; ALT和AST赖氏法测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所; Masson三色染色试剂盒购于迈新试剂公司;维生素购自沈阳禾丰生物技术有限公司。

1.3分组及动物模型制备小鼠适应性饲养1周，自由采食饮水(水中添加维生素)。1周后，将实验动物随机分为空白对照组(10只)、模型组(10只)和牛磺酸处理组(10只)。空白对照组按0.3 mL/100 g体质量腹腔注射橄榄油;模型组和牛磺酸处理组按0.3 mL/100 g体质量腹腔注射40% (体积比)四氯化碳橄榄油溶液制备肝纤维化模型，首次注射剂量0.5 mL/100g。在造模的同时，空白对照组和模型组饮用纯净水，牛磺酸处理组在纯净水中添加牛磺酸，浓度为2%，即2 g牛磺酸溶于100 mL水中。三组均每周注射2次，共注射10周，每周称取体质量1次。

1.4观察指标及方法10周后处死小鼠，摘眼球取血，制备血清，检测血清中透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白细胞介素(IL) -2和IL-6。摘取肝脏称质量，计算肝脏指数(肝脏质量/体质量)。部分肝脏储存在－80℃冰箱中，用以检测肝脏组织中的超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA) ;部分肝脏组织用10%甲醛溶液固定，采用HE和Masson染色，观察肝脏组织病理学变化。

1.5统计学方法采用SPSS16.0统计软件。计量资料用珋x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1三组血清HA、LN、ALT及AST水平比较三组血清HA、LN、ALT及AST水平比较有统计学差异(P均＜0.05)。模型组血清HA、LN、ALT及AST水平高于空白对照组(P均＜0.05)，牛磺酸处理组HA、LN、ALT及AST水平低于模型组(P均＜0.05)。见表1。

表1　三组血清HA、LN、ALT及AST水平比较(±s)

注:与模型组比较，*P＜0.05;与空白对照组比较，#P＜0.05。

组别　n　HA(μg/L)　LN(μg/L)　ALT(U/L)　AST(U/L)空白对照组　10　584.24±16.79　41.30±1.24　34.61±1.41　79.75±3.41模型组　10　785.43±22.22#　101.89±1.94#　371.82±6.94#　398.47±2.86#牛磺酸处理组　10　613.86±20.83*　67.89±1.57*　41.80±1.85*　84.58±2.86*

2.2三组肝组织脂质过氧化物及血清炎症因子水平比较三组肝组织SOD、MDA及血清IL-2、IL-6水平比较差异有统计学意义(P均＜0.05) ;与模型组比较牛磺酸处理组、SOD水平升高，MDA、IL-2、IL-6水平降低(P均＜0.05)。见表2。

表2三组肝组织脂质过氧化物及炎症因子水平比较(±s)

注:与模型组比较，*P＜0.05;与空白对照组比较，#P＜0.05。

组别　n　SOD (U/mg)　MDA (nmol/mg)　IL-2(μg/L)　IL-6 (pg/mL)空白对照组　10　233.67±13.86　1.07±0.17　2.81±0.23　56.17±1.96模型组　10　121.53±7.68#　4.69±0.43#　5.89±0.14#　110.90±1.81#牛磺酸处理组　10　199.22±5.90*　2.18±0.28*　2.97±0.13*　64.50±1.49*

2.3三组肝脏指数比较空白对照组、模型组、牛磺酸处理组肝脏指数分别为(2.79±0.18) %、(4.36±0.12) %、(2.85±0.15) %，模型组肝脏指数高于牛磺酸处理组、空白对照组(P均＜0.05)，牛磺酸处理组、空白对照组肝脏指数比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.4小鼠肝脏组织病理检查结果空白对照组小鼠肝细胞体积较大，呈多面体形，核大而圆，核膜完整，位于细胞中央;肝细胞索以中央静脉为中心向四周呈放射状排列，肝板间为不规则的肝窦;肝细胞连接紧密，中央静脉和门管区无纤维增生。模型组小鼠肝小叶界限不清，胞质内还可见多个大小不等的脂肪空泡，出现炎性细胞浸润;肝细胞索排列紊乱，肝窦变窄;肝脏中纤维组织增生，分割包绕假小叶。牛磺酸处理组肝组织结构有较明显改善，肝细胞脂肪变性显著减轻，未见炎性细胞浸润与假小叶形成;纤维沉积显著减少。

3　讨论

正常情况下，血清中HA和LN水平较低;当肝脏功能出现障碍时，HA和LN的合成增加、降解相对减少，发生大量沉积，最终引起肝纤维化［4，5］。四氯化碳是肝毒性化合物，其破坏肝细胞的作用机理与氧化应激和脂质过氧化反应有关;脂质过氧化能够溶解磷脂膜，破坏细胞膜的结构和通透性，导致钙超载;四氯化碳代谢产物还可以刺激肝脏枯否细胞释放促炎性细胞因子，进一步加重肝脏的损伤［6］。本研究采用小鼠腹腔注射四氯化碳制备肝纤维化模型，结果显示模型组小鼠血清中HA、LN、ALT、AST、IL-2和IL-6水平升高，肝脏组织中SOD水平降低、MDA水平升高，肝脏指数增大，表明肝细胞严重损伤。牛磺酸处理组小鼠经牛磺酸处理，肝细胞得到保护，肝脏纤维化得到有效控制。

牛磺酸是体内分布广泛、效应多样的自身调节物质，它虽然不参与蛋白质的合成，但是参与维持机体内环境稳定，在抗炎、抗氧化、改善糖脂代谢和调节钙离子等方面起着重要的作用［7］。牛磺酸在肝脏中与胆酸结合生成牛磺胆酸，能促进脂肪乳化、增强脂肪酶活性，并协助胆固醇、中性脂肪、脂溶性维生素及其他脂溶性物质的消化吸收［8］。病理切片显示模型组肝细胞出现大量的空泡，呈脂肪变性，而经牛磺酸处理后脂肪变性显著减少。MDA是氧化应激常用的标志物，由多不饱和脂肪酸过氧化分解产生，常被用来间接反应机体的自由基代谢变化及细胞的损伤程度［9］。牛磺酸能够显著降低肝脏组织中MDA水平，减轻过氧化反应，减轻MDA对机体的损伤。牛磺酸作为抗氧化剂可以通过减少活性氧的产生、清除活性氧和干扰活性氧的活性防止自由基损伤细胞［10］。经牛磺酸处理后，肝脏组织中SOD水平显著提高，使细胞中有足够的SOD对抗过氧化反应，清除氧自由基，保护细胞膜免受自由基的攻击。机体内SOD和MDA的水平能够反映出机体清除自由基的能力和受到自由基损伤的程度。氧化应激促进炎症，而炎症反应又加剧氧化应激，两者互为因果。

IL-2是调控免疫应答的重要因子，主要是由活化的T淋巴细胞产生，通过调节体液免疫和细胞免疫参与炎症反应的发生和发展。IL-6与其他细胞因子协同作用，使肝细胞内发生持续炎症反应。活化的肝星状细胞(HSC)大量生成IL-6，而IL-6反过来刺激HSC，两者互相作用产生恶性循环使得HSC呈持续活化状态，导致其增殖并分泌大量的胶原。IL-6通过增加合成急性期反应蛋白物和减少合成白蛋白，上调Ⅰ型胶原及组织金属蛋白酶抑制物mRNA的转录，抑制金属蛋白酶的释放，促进肝纤维化的发展［11］。本研究显示，模型组血清中IL-2、IL-6水平升高，且肝细胞出现炎性细胞浸润;牛磺酸处理组血清中IL-2、IL-6水平降低。与模型组比较，牛磺酸处理组肝组织结构明显改善，肝细胞脂肪变性显著减轻，未见炎性细胞浸润与假小叶形成，纤维沉积显著减少。因此认为牛磺酸能够减少肝内炎性反应，减轻肝细胞的免疫损伤。

综上所述，牛磺酸可以调节肝脏脂肪代谢，清除氧自由基，增加机体抗脂质过氧化能力，抑制炎症反应，稳定细胞膜通透性，减少胶原的产生和沉积，最终抑制肝纤维化的发生与发展。

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Inhibitory effect of taurine on liver fibrosis in mice

LIU Hong1，GAO Yuan-zhi，TIAN Jing-jing，WANG Xue-liang，BAI Jian
(1 Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China)

Abstract:Objective To observe the changes of liver injury，fibrosis，oxidative stress and inflammation indexes before and after treatment of taurine in carbon tetrachloride-induced liver fibrosis of mice，and to investigate the inhibitory effect of taurine on liver fibrosis in mice.Methods Thirty mice were randomly divided into three groups including blank control group，model group and taurine treatment group，10 mice in each group.Mice in the model and taurine treatment groups were injected carbon tetrachloride in enterocoelia to build the liver fibrosis model.At the same time，mice in the taurine treatment group were fed by taurine in drinking water.After 10 weeks，peripheral blood and serum were collected.Hyaluronic acid (HA)，layer adhesion protein (LN)，alanine aminotransferase (ALT)，aspartate aminotransferase (AST)，interleukin 2 (IL-2) and IL-6 in the serum were detected.The liver index was calculated; the super oxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) level in the liver tissues was detected; and pathological changes of liver tissues were stained by HE and Masson.Results Compared with the model group，HA，LN，ALT，AST，IL-2 and IL-6 levels in the serum were decreased in the taurine treatment group (all P＜0.05) ; and SOD in the liver tissue was increased，MDA level，liver indexes were decreased in the liver tissues (all P＜0.05).The pathological examination showed that the inflammatory infiltrates in the liver tissue and fat cavitation significantly reduced and fibrous tissue deposition could not be found.ConclusionTaurine has a certain inhibitory effect on carbon tetrachloride induced liver fibrosis in mice.

Key words:liver fibrosis，mice; taurine; hyaluronic acid; layer adhesion protein; super oxide dismutase; malondialdehyde; interleukin 2; interleukin 6

(收稿日期:2015-03-31)

通信作者简介:白剑(1979-)，男，实验师，主要从事肝脏纤维化研究。E-mail: baijian988@ hotmail.com

作者简介:第一刘鸿(1986-)，男，助理实验师，主要从事牛磺酸生物学功能的研究。E-mail: 710301527@ qq.com

基金项目:辽宁省自然科学基金资助项目(201101142) ;辽宁省社会发展攻关计划(2012225018)。

文章编号:1002-266X(2015)21-0017-03

文献标志码:A

中图分类号:R575; R-332

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.006