人脐带组织间充质干细胞对小鼠肿瘤的趋化作用

房敬超，张晓龙，张晴，曹蕾，姜爱娜，李茜(协和干细胞基因工程有限公司，天津300384;中国医学科学院北京协和医学院血液病医院血液学研究所，实验血液学国家重点实验室)

人脐带组织间充质干细胞对小鼠肿瘤的趋化作用

房敬超1，张晓龙2，张晴2，曹蕾1，姜爱娜1，李茜1
(1协和干细胞基因工程有限公司，天津300384;2中国医学科学院北京协和医学院血液病医院血液学研究所，实验血液学国家重点实验室)

摘要:目的观察人脐带组织间充质干细胞(MSCs)对小鼠B系恶性淋巴瘤和肝癌的趋化作用。方法通过酶切、连接等方法构建pLenti-fLuc慢病毒表达载体，利用293T细胞包装慢病毒颗粒，并感染人脐带组织华通氏胶来源的MSCs(WJ-MSCs)，使其表达萤火虫荧光素酶(fLuc)。分别于NOD/SCID小鼠中建立BJAB淋巴瘤细胞皮下移植模型及BALB/c裸鼠中建立HepG2肝癌原位移植瘤模型，经尾静脉将MSCs-fLuc注射至荷瘤小鼠体内，采用体内生物发光成像系统观察MSCs-fLuc向肿瘤部位的迁移情况。结果成功构建慢病毒表达载体pLenti-fLuc，且经慢病毒感染可在WJ-MSCs中稳定表达。成功建立BJAB淋巴瘤细胞皮下移植瘤模型，MSCs-fLuc经小鼠尾静脉注射24 h后选择性地定位于肿瘤部位。成功建立BALB/c裸鼠的HepG2肝癌皮下原位移植瘤模型，MSCs-fLuc经尾静脉注射2 d后迁移并聚集于肝脏。结论WJ-MSCs具有向小鼠淋巴瘤和肝癌归巢的能力，此为以MSCs为载体的肿瘤靶向治疗提供了实验基础。

关键词:淋巴瘤;肝肿瘤;间充质干细胞;生物发光成像;趋化作用;小鼠

间充质干细胞(MSCs)为一群异质性的非造血干细胞，具有高度增殖活性和多向分化潜能，广泛分布于全身多种组织［1～6］。MSCs具有低免疫源性、分离纯化方便、易于基因改造以及向肿瘤部位归巢等特点［7～9］，已成为肿瘤靶向治疗的理想载体。活体动物体内光学成像系统(IVIS)通过灵敏的光学检测仪器可以直接监控生物体内的细胞活动和基因行为，相比传统的动物实验所得的数据更加真实可信。为了研究MSCs在体内对肿瘤的趋化作用，2013年6月～2014年9月，我们用萤火虫荧光素酶(fLuc)标记了人脐带华通氏胶来源的间充质干细胞(WJMSCs)，并观察其对小鼠B系恶性淋巴瘤和肝癌的趋化作用。

1　材料与方法

1.1材料pGL3-basic载体、慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP及包装载体pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSV-G由本室保存;大肠杆菌DH5α购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2WJ-MSCs的分离、培养及鉴定从手术台上取下的人脐带在24 h内进行处理，用含双抗的PBS冲洗脐带，将其剪成1 cm长的小块，冲洗干净;剥离脐带动静脉血管壁，取华通氏胶部分，剪碎至0.5 cm3大小，依次摆放于预先湿润的T-75塑料培养瓶中倒置培养; 4～8 h后翻转培养瓶，次日添加1 mL 含10%FBS及2 mmol/L L-谷氨酰胺的DF-12培养基，连续添加3 d，第4天全量换液，以后每周换液两次;培养10～14 d后，去除组织块，用含0.125%胰酶及0.01%EDTA的细胞消化液消化细胞，进行初次原瓶传代，待细胞长至60%～70%融合时，二次传代(3×103/cm2)或冻存。取第3～5代的WJMSCs用于实验。收集对数生长期的WJ-MSCs，冷PBS洗涤3次，将细胞分别重悬于20 μL直标抗体CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE中，4℃孵育1 h，PBS洗涤3次后重悬于400 μL PBS中，流式细胞仪检测WJ-MSCs相应表型的阳性率。

1.3慢病毒表达载体pLenti-fLuc的构建按照质粒小提试剂盒(DP103-03，天根生化科技有限公司)操作步骤，利用Nhe I、BamH I双酶切慢病毒表达载体pLenti-R和含fLuc报告基因的载体pGL3-basic。1%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，并用琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒纯化回收得到载体大片段和编码荧光素酶的小片段。用T4快速连接酶(北京全式金生物技术有限公司)连接两片段，连接产物转化至DH5α感受态菌，挑取单克隆于2-YT(含氨苄青霉素100 μg/mL)培养基中培养12～16 h。小提质粒，用Nhe I和BamH I双酶切鉴定，并于－80℃冻存鉴定正确的克隆。

1.4慢病毒的包装及感染WJ-MSCs按照无内毒素质粒大提试剂盒(DP117，天根生化科技有限公司)的操作步骤同时提取3种慢病毒包装质粒pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV和pVSV-G以及慢病毒表达载体pLenti-fLuc。胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，按2×106/mL的细胞密度接种5 mL至10 cm培养板中，于37℃、5% CO2培养箱中培养过夜。按照LipofectaminTM2000操作步骤，将4种质粒pPACKH1-GAG(6 μg)、pPACKH1-REV(2 μg)、pVSV-G(2 μg)以及pLenti-fLuc(2 μg)共同转染至293T细胞中。转染48 h后收集293T细胞培养上清，4℃离心(4 000 r/min，10 min)去除细胞碎片，并用0.45 μm滤器过滤。病毒上清直接用于感染细胞或－80℃中保存。取第3～5代的WJ-MSCs 按8×103个/cm2的密度接种于T-75培养瓶中。次日，将WJ-MSCs培养基换为含病毒上清的DF-12培养基(按MOI=8将病毒上清与新鲜含10% FBS的DF-12培养基混合成8 mL，同时加入polybrene，终浓度为8 μg/mL)，12 h后终止感染。WJ-MSCs经慢病毒感染后第4天，荧光显微镜下观察CopGFP荧光，0.125%胰酶消化后收集细胞用于体内实验，或液氮冻存。

1.5MSC-fLuc中报告基因fLuc的表达检测用含fLuc报告基因的慢病毒颗粒按照MOI=8感染WJMSCs，使其稳定表达fLuc。取24孔板1块，分别加入5×102、1×103、5×103、1×104、5×104、1×105、5 ×105个细胞，并设PBS空白对照。每孔加入终浓度为150 μg/mL的D-luciferin，30 s后在IVIS上检测生物发光情况。

1.6荷瘤小鼠模型的建立

1.6.1BJAB移植瘤模型的建立选用雌性6周龄NOD/SCID小鼠(中国协和医科大学实验动物中心提供) 6只，体质量18～20 g，于SPF级环境下饲养，并对小鼠行γ射线(260 cGy/只)照射。BJAB细胞培养于含10% FBS的RPMI1640完全培养基中，收集对数生长期的BJAB细胞，冷PBS洗涤2次，调整细胞密度为2.5×107/mL，于小鼠右前肢根部背侧皮下接种BJAB细胞，每只小鼠接种200 μL，待肿瘤生长至200～300 mm3时进行实验。

1.6.2HepG2肝癌皮下原位移植瘤模型的建立选用雌性5周龄BALB/c裸鼠(中国协和医科大学实验动物中心提供) 15只，体质量18～20 g，于SPF级环境下饲养。取其中5只皮下接种前5 h对小鼠行γ射线照射。HepG2肝癌细胞培养于含10% FBS 的DMEM完全培养基中，取对数生长期的HepG2肝癌细胞经胰酶消化后用冷PBS洗涤2次，调整细胞密度为2.5×107/mL。用带21 G针头的1 mL注射器于小鼠右后肢根部背侧皮下接种HepG2细胞，每只小鼠接种200 μL。接种后约2周左右肿瘤成长至1 cm3。原位移植参照文献［10］进行，脱颈处死皮下移植瘤小鼠，无菌条件下取鱼肉状瘤组织，放入含有庆大霉素的生理盐水中漂洗，并修剪成1～2 mm3大小备用。另取10只使用2%戊巴比妥钠以100 mg/kg的剂量行腹腔麻醉，常规消毒后沿剑突下腹中线剪开1～2 cm，挤出肝脏，用手术刀切一小口，将瘤块用眼科镊放入切口约3 mm深，用生理盐水浸润的纱布止血1 min以防止瘤块脱落。缝合切口后用红霉素眼膏涂于切口处预防感染。术后2周，脱颈处死小鼠，取肝脏、肺、脾、肾进行病理学检查，确定原位模型是否建立成功及有无转移。

1.7MSCs-fLuc对肿瘤的趋化作用观察待BJAB皮下移植瘤长至200～300 mm3及HepG2肝癌原位移植瘤模型建立后，经尾静脉注射200 μL MSCsfLuc细胞悬液(5×105个细胞/只) ;注射24 h后，小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(浓度2%)，待小鼠麻醉后按150 μg/g腹腔注射荧光素酶底物D-luciferin。10 min后，采用IVIS观察MSCs-fLuc对肿瘤的趋化作用。

2　结果

2.1WJ-MSCs的分离及鉴定结果倒置显微镜下可观察到分离的WJ-MSCs成纤维状梭形贴壁生长。流式细胞仪测定WJ-MSCs的表面标志CD73、CD90、CD105阳性率均在99%以上。

2.2MSCs-fLuc中fLuc的表达荧光显微镜下观察MSCs-fLuc可见绿色荧光，证明MSCs-fLuc高效表达fLuc。WJ-MSCs感染后第4天，流式细胞仪检测感染效率达71.3%。IVIS观察发现发光信号强度与MSCs-fLuc的数量呈正相关。

2.3WJ-MSCs对肿瘤的趋化作用在NOD/SCID小鼠体内成功建立BJAB皮下移植瘤模型; IVIS观察可见肿瘤部位BLI信号(曝光时间为5 min)，证明在小鼠体内WJ-MSCs向BJAB肿瘤部位定向迁移。在BALB/c裸鼠中建立人肝癌HepG2细胞的皮下原位移植瘤模型;病理学检查结果显示，原位移植后2周，小鼠肝脏可见肿瘤结节形成，结节中央大片坏死，且坏死部分有大量分叶核炎细胞浸润，其他脏器如肺、脾、肾不见转移; MSCs-fLuc经尾静脉注射入荷瘤小鼠，24 h后IVIS观察发现细胞聚集于肝脏肿瘤部位。

3　讨论

目前，有关骨髓、脂肪以及脐带血来源的MSCs用于肿瘤治疗的研究报道较多，而对于人脐带组织WJ-MSCs介导的肿瘤靶向治疗研究较少。WJ-MSCs除具有传统骨髓来源MSCs的特点外还拥有其自身优点，如分离方便、易于基因改造、增殖速度快、免疫源性低等，同时WJ-MSCs的使用不涉及伦理学问题。因此WJ-MSCs越来越受到临床及基础研究的重视。MSCs的可塑性及其向损伤部位迁移的能力使其成为组织再生修复中的有利工具［11］。实体瘤浸润并破坏正常组织形成肿瘤微环境，同时分泌大量趋化因子及其他蛋白，这一微环境与损伤组织的微环境极为相似，因此MSCs会将肿瘤认为是正常损伤或是炎症部位，从而向肿瘤部位迁移。这一特点可使MSCs作为细胞载体用于基因治疗。MSCs可将抗肿瘤药物(细胞因子、干扰素、凋亡诱导剂等)运输至肿瘤部位从而抑制肿瘤的生长［12，13］。

IVIS是运用生物发光或荧光报告基因来追踪标记细胞在体内活动过程的一项成像技术。本实验中我们将fLuc标记的WJ-MSCs注射至荷瘤小鼠体内，趋化到肿瘤部位的MSCs表达fLuc，在底物荧光素以及氧、ATP的存在下通过酶促反应产生光子，产生的光子可被IVIS检测到。IVIS方便、灵敏，为体内观察细胞的动向提供了直观、可靠的数据。本研究采用IVIS观察发现WJMSCs经尾静脉注射24 h后聚集于肿瘤部位。有研究对MSCs的趋化作用解释为MSCs跨过内皮细胞而被某种组织的脉管系统捕获的过程［14］，但MSCs趋化作用的具体机制尚未阐明。目前，普遍认为MSCs表面的趋化因子受体在相应趋化因子或细胞因子的诱导下使其发生定向迁移;其中依赖CXCR4-SDF-1相互作用产生的迁移在肾细胞癌［15］、乳腺癌［16］等恶性肿瘤中也存在。本研究仅观察了WJ-MSCs对淋巴瘤及肝癌的趋化作用，而且其中涉及的具体机制还有待进一步研究。

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Chemotaxis of mesenchymal stem cells in human umbilical cord tissues on tumor in mice

FANG Jing-chao1，ZHANG Xiao-long，ZHANG Qing，CAO Lei，JIANG Ai-na，LI Qian
(1 Union Stemcell＆Gene Engineering Co.LTD，Tianjin 300384，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the tropism of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (MSCs) for malignant lymphoma of B department and liver carcinoma by using in vivo bioluminescent imaging system (IVIS).Methods The lentivirus expression vector pLenti-fLuc was constructed by restriction enzyme cleavage and linkage.Human umbilical cord Wharton＇s Jelly-derived MSCs (WJ-MSCs) were labeled with firefly luciferase (fLuc) by stable transfection with lentivirus which had been packaged in 293T cells.To demonstrate the tumor tropism of WJ-MSCs，MSC.fLuc were injected intravenously into NOD/SCID mice bearing BJAB lymphoma or BALB/c nude mice which burdened hepatocellular carcinoma in situ with HepG2cells，and the migration in vivo was monitored by IVIS.Results The lentivirus expression vector pLenti-fLuc was successfully constructed，and the expression of fLuc was stable in WJ-MSCs by transfection with lentivirus.The subcutaneous BJAB lymphoma xenograft model was successfully established in NOD/SCID mice，and MSC.fLuc migrated to tumor site after 24 hours by intravenous injection.The HepG2orthotopic hepatocarcima model was successfully established in BALB/c nude mice.When it was injected intravenously，MSC.fLuc＇s tropism for liver was found 48 hours later.Conclusion WJ-MSCs have the capacity of tumor tropism for lymphoma and hepatocarcima，and it provides basis for tumor-targeting therapy which uses MSCs as the vector.

Key words:lymphoma; liver neoplasms; mesenchymal stem cells; bioluminescence imaging; chemotaxis; mice

(收稿日期:2015-02-12)

通信作者简介:李茜(1961-)，女，副研究员，主要从事细胞生物学研究。E-mail: 1360501260@ qq.com

作者简介:第一房敬超(1980-)，女，实习研究员，主要从事脐带间充质干细胞肿瘤趋化研究。E-mail: fangjch_80@163.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目(30971291)。

文章编号:1002-266X(2015)21-0001-04

文献标志码:A

中图分类号:R73-3; R394

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.001