高灌蓝莓CBF基因的单核苷酸多态性分析

2014-03-24 10:18魏海蓉等
山东农业科学 2014年2期
关键词:蓝莓

魏海蓉等

摘要:本研究以21个高灌蓝莓品种为试材,克隆VcCBF基因,测序后分析其单核苷酸多态性(SNP),共克隆到123个非重复序列,发现120个SNP位点,单核苷酸多态性发生频率为1/695bp,核苷酸多态性值(Pi)为0.01251。在120个SNP位点中,单态突变位点62个;简约信息位点58个,其中双突变55个,三突变3个。对其碱基替换方式进行分析发现,转换91个,颠换26个,转换与颠换的发生比率为3.5∶1。通过单倍型分析发现,21个蓝莓品种的VcCBF基因存在5种单倍型。

关键词:CBF;单核苷酸多态性(SNP);蓝莓

中图分类号:Q524+.3文献标识号:A文章编号:1001-4942(2014)02-0008-03

CBF基因(也称为DREB1基因)编码一个具有AP2结构域的转录激活子,能够结合到CRT(C-repeat)或DRE(dehydration-responsive element)顺式作用元件上,调节植物冷适应相关基因的表达[1]。CBF基因是植物冷适应及信号传导领域最有意义的发现之一,多种与植物冷适应相关的基因都受其调控,目前已在多种重要的农作物及蔬菜中发现该基因[2~4]。Polashock等[5]从高灌蓝莓(Vaccinium corymbosum)品种蓝丰(Bluecrop)和兔眼蓝莓(Vaccinium virgatum) 品种梯芙蓝(Tifblue)中克隆到CBF基因并验证其功能,发现CBF基因表达量和表达模式的差异可能与品种间的抗寒性不同有关。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)是指在基因组水平上由单核苷酸变异引起的一种序列多态性[6]。在所有可能的DNA序列差异性中,单核苷酸多态性是发生频率最高的变异,人类90%左右的DNA序列多态性都是单核苷酸多态性[7]。单核苷酸多态性具有数量大、分布广、稳定性强、易于分型等优点,在人类疾病的诊断及治疗、致病基因的发现、族群的演化研究等方面起到了重要作用,同时在小麦、玉米、大豆等作物的物理作图、进化研究、遗传研究中也是有效的分子标记[6, 8~11]。

本研究以21个不同品种的高灌蓝莓为材料,克隆VcCBF基因,采用直接测序法筛查其单核苷酸多态性,以期为研究VcCBF基因与蓝莓抗寒性的关系奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

本研究所用的21个高灌蓝莓品种采自山东省果树研究所蓝莓品种资源圃,分别为伯克利(Berkeley)、喜来(Sierra)、陶柔(Toro)、都克(Duke)、日出(Sunrise)、蓝丰(Bluecrop)、埃利奥特(Elliott)、达柔(Darrow)、蓝塔(Bluetta)、泽西(Jersey)、布里吉塔(Brigitta)、早蓝(Earliblue)、晚蓝(Lateblue)、蓝金(Bluegold)、瑞卡(Reka)、佐治亚宝石(Georgiagem)、密斯提(Misty)、奥尼尔(ONeal)、夏普蓝(Sharpblue)、罗卫(Reveille)和普鲁(Puru)。

1.2VcCBF基因的克隆、测序及单核苷酸多态性分析

以蓝莓幼嫩叶片为材料,采用TIANGEN植物基因组提取试剂盒提取基因组DNA, 根据已发表的蓝莓CBF基因序列设计引物进行PCR扩增。 扩增所用上游引物为5′-GAATCGTCGATGGAATATAACT-3′,下游引物为5′-TCTAAAATCTAACTCCACAACG-3′。PCR产物回收后采用pMD18-T载体(TaKaRa公司)连接,转化DH5α感受态细胞,在含有Amp的LB平板上培养过夜后,挑取菌落进行菌落PCR筛选阳性克隆,每个品种选取8个,送上海生工生物工程有限公司测序[12],所得序列采用DnaSP v5软件分析[13]。

2结果与分析

2.1VcCBF基因的克隆

PCR所得目的片段长度为698 bp,编码区长681 bp,将测序结果进行比对,除去重复序列,共得到123个非重复序列,每个品种有4~8个,结果见表1。

2.2VcCBF基因的单核苷酸多态性分析

将得到的123个VcCBF基因编码区非重复序列用DnaSP v5软件进行单核苷酸多态性分析,结果见表2。共发现了120个SNP位点,全部为单核苷酸替换,没有InDel的情况发生,SNP的发生频率为1/695bp,核苷酸多态性值(Pi)为0.01251。在120个SNP位点中,单态突变位点(singleton variable sites)62个,简约信息位点(parsimony informative sites)58个,简约信息位点中,双突变55个,三突变3个(表3)。

3讨论与结论

本研究通过对21个蓝莓品种VcCBF基因的克隆测序,得到123个非重复序列,测序总长度83 394 bp,在VcCBF基因编码区共发现120个多态性位点,单核苷酸多态性发生频率为1/695bp,核苷酸多态性值(Pi)为0.01251。相对于其他物种,VcCBF基因的单核苷酸多态性频率较低,这可能与其受到的选择压力较大相关。通过对120个SNP位点的具体分析,发现单态突变位点有62个,简约信息位点58个(双突变55个,三突变3个)。对碱基替换方式进行分析,发现转换有91个,颠换为26个,转换与颠换的比率为3.5∶1。进一步通过组装一致序列,进行单倍型分析,发现21个蓝莓品种中有5种单倍型。

直接测序法筛查SNP也存在不足,首先在克隆和测序过程中会造成假阳性,在检测到的62个单态突变位点中可能存在克隆或测序错误造成的误差。此外,高灌蓝莓品种为四倍体,且多为杂交选育而来,其本身VcCBF基因的情况较为复杂,本研究从每个品种筛选8个阳性克隆进行测序,可能没有涵盖所有的内源VcCBF基因,从而对分析其单核苷酸多态性和单倍型造成不足。本研究对高灌蓝莓CBF基因进行了初步分析,找到了部分VcCBF基因的单倍型,但每种单倍型对高灌蓝莓抗寒性的贡献还需进一步研究。

参考文献:

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