Snapshot法测定ET—1基因Taq I多态性与海南汉族老年脑梗死的关联性研究

邱逸敏+吴恳+苏春妮+黄维益+王镇+张云霞

【摘要】目的：研究内皮素基因1（ET-1）Taq I（rs2071942）位点多态性与海南汉族老年脑梗死关联性。方法：选用150例海南省老年脑梗死患者作为实验组，健康对照311例作为对照组，提取基因组DNA，利用snapshot的方法测定Taq I基因多态性。利用软件SPSS17.0分析组间差异。结果：两组中均可检测出三种基因型GG、GA、AA，三种基因型在实验组中的分布频率为79（52.7%）、53（35.3%）、18（12%），在对照组中的分布频率为159（51.1%）、112（36.0%）、40（12.9%），组间基因型分布频率没有明显差异。等位基因G和A在实验组的分布频率为211（70.3%）、89（29.7%），在对照组中的分布频率为430（69.1%）、192（30.9%），统计学分析结果显示组间也没有明显差异。结论：ET-1的Taq I位点多态性与海南汉族脑梗死疾病没有关联性。

【关键词】脑梗死 ；内皮素 ； 单核苷酸多态性 ； Taq I

【中图分类号】R742【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2014）08 2008年卫生部调查结果显示，脑血管疾病成为我国居民第一死亡因素，而脑梗死则是脑血管疾病中最为严重的一种，它是指由于患者脑部供血障碍引起的脑组织缺血、缺氧而发生坏死、软化形成梗死的脑血管疾病，该病具有典型的发病率、致残率、病死率三高的特点，成为我国居民身体健康的“无声杀手”[1]。国内外医务工作者和科研工作者分别从不同的角度对脑梗死的病因进行了研究，一般认为高血压、心脏病、糖尿病、高血脂、高血粘度等因素通过影响血液成分的变化及血流动力学的变化而导致血栓形成，发生脑梗死，而遗传因素也是脑梗死发生的重要影响因素之一[2-4]。

内皮素是血管收缩性物质，对调节心血管功能、维持基础血管张力及心血管系统的稳定性具有重要作用。ET-1是迄今为止发现的收缩功能最强的内源性物质，其增高不但与脑梗死的发病有关，与其发展过程中也有着密切关系[5]。遗传多态性是影响蛋白质结构及表达水平的重要因素，也是疾病发生的基础。内皮素的编码基因ET-1存在遗传多态，其中Taq I（rs2071942）是内皮素内含子-4G8002A的G/A转换的多态位点。本研究选择了脑梗死及健康对照人群，试图通过比对研究探讨该位点的突变是否与海南汉族老年脑梗死存在关联。

1研究对象与方法

1.1研究对象

（1）正常对照组：无血缘关系的海南汉族健康个体311例，肝肾功能正常， 排除高血压病、心血管疾病、糖尿病及血液病病史。对照组中男女比例为194/117，年龄均大于60岁，平均年龄为68.7岁。（2）脑梗死患者组：海南省老年病医院心血管内科住院部汉族脑梗死患者150例，所有病例均经头部CT扫描确定为脑梗死，并且符合第四届脑血管病学术会议修订的“各类脑血管病诊断要点”中相关诊断标准。其中男女比例为93/57，年龄均在60岁以上，平均年龄为69.3岁。经统计学分析显示两组患者年龄、性别比例及体重等一般体征无显著差异，存在可比性（P>0.05）。

1.2 ET-1基因多态性检测

1.2.1 基因组DNA的获得：所有入选者采集EDTA抗凝血3ml，利用北京天根生化科技有限公司的TIANamp Genomic DNA Kit提取基因组DNA。

1.2.2 基因序列的获得及引物设计：从GENBANK中获取人类ET-1编码基因，并获得rs2071942的位点信息（GTATTTACCACTTTCCCTGAGAAATC[A/G]AAAATCATTTTGGGGAGCGGACATT）。根据以上信息在rs2071942位点两侧设计两个引物（P11 CACATAC CATTTCATCTACAGG，P22GGCCATCTGAAT AACTGCAAC），引物扩增片段的长度为218bp。③PCR扩增体系及条件：每管在1×PCR缓冲液（10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2）中含模板DNA 0.2 μg，引物各0.2～0.5 μmol/L，4种dNTP各100 μmol/L， Taq DNA聚合酶（北京天根公司产品）1U，扩增体系为15ul。PCR循环参数为：首先在95℃预变性3min，之后进行11个循环反应（每个循环包括94℃ 15s， 60℃15s），循环完成后72℃温育30s，接着进行24个循环反应（每个循环包括94℃ 15s， 60℃15s），循环完成后72℃温育3min。④PCR产物的纯化：PCR扩增后取3ul PCR产物用ExoI和FastAP纯化，主要是用ExoI去除反应产物中的剩余引物，用FastAP去除反应中剩余的DNTP。⑤SNP分型 利用延伸引物TACCACTTTCC CTGAGAAATC进行延伸反应，取1ul延伸产物，加8ul上样loading，95°C变性3min，立即冰水浴，上测序仪进行分型。

1.3统计学处理方法

基因频率采用基因计数法计算。组间基因型与等位基因频率比较用2检验。组间年龄、性别、体重等计量资料用t检验。以上统计学处理均采用SPSS16.0软件进行分析。

2研究结果

2.1基因分型结果

如图1-3所示，延伸产物碱基的对应颜色A：绿色 G：蓝色，图1-3表示基因型分别为AG、AA、GG。

图1 SNP分型为AG

图2 SNP分型为AA

图3 SNP分型为GG

两组中均可检测出三种基因型AA、AG、GG，三种基因型在实验组中的分布频率为79（52.7%）、53（35.3%）、18（12%），在对照组中的分布频率为159（51.1%）、112（36.0%）、40（12.9%），组间基因型分布频率均无显著差异 （P>0.05）。

等位基因G和A在实验组的分布频率为211（70.3%）、89（29.7%），在对照组中的分布频率为430（69.1%）、192（30.9%），统计学分析结果显示组间也没有明显差异（P>0.05）。

表1两组患者基因型分布频率

基因型 实验组（例/率） 对照组（例/率）GG 79（52.7%） 159（51.1%）GA 53（35.3%） 112（36.0%）AA 17（11.3%） 40（12.9%）

表2两组患者等位基因分布频率

等位基因 实验组（例/率） 对照组（例/率）G 211（70.3%） 430（69.1%）A 88（29.7%） 192（30.9%）

3讨论

老龄化社会的到来使得老年性疾病的发生率逐日增高，脑梗死的三高的特点成为老年人身体健康的重要威胁因素，也是影响老年患者生存质量的重要因素，彻底破解脑梗死发生的原因是防治该病的必要前提。诸多研究从不同的角度对该病的发病原因进行了探讨，但到目前为止依然没有确切的答案。

内皮素对心血管系统的稳定性具有重要作用，而目前发现的三类内皮素中，内皮素-1被发现收缩功能最强。金启建等检测脑梗死病人ET-1的水平并与正常对照比较，研究结果显示脑梗死病人血清ET-1水平明显高于正常对照组。众多相关研究指向ET-1增高是脑梗死发病的内源性危险因素之一[6]。

我们对海南汉族人群中脑梗死和健康对照进行了比对研究，结果显示两组中均可检测出三种基因型GG、GA、AA，三种基因型在实验组中的分布频率为7979（52.7%）、53（35.3%）、18（12%），在对照组中的分布频率为159（51.1%）、112（36.0%）、40（12.9%）组间基因型分布频率均无明显差异（P>0.05）。等位基因G和A在实验组的分布频率为211（70.3%）、89（29.7%），在对照组中的分布频率为430（69.1%）、192（30.9%），统计学分析结果显示组间差异无显著（P>0.05）。以上研究结果说明，ET-1的Taq I位点多态性与海南汉族脑梗死疾病没有关联性。

参考文献

[1]Kevin M. Barrett； James F. Meschia. Cerebral infarction in older age. Neurology， 2012，79（15）：1524-1525

[2] Ueda N，Satoh S， Kuroiwa Y. Multiple cerebral infarction and cardiomyopathy with pheochromocytoma. The Neurologist，2011，17（1）：34-37

[3]杨发满.老年脑梗死患者血栓调节蛋白及IL-6水平[J].中国老年学杂志，2013，（第18期）：4573-4574

[4]李红娟，李庆.脑梗死患者相关危险因素分析[J].中国卫生检验杂志，2013，（第2期）.：487-488，491

[5]刘静波.急性脑梗死患者血浆内皮素表达水平的临床研究[J].中华全科医学，2013，（第8期）：1329-1240

[6]杭丽玮，周建中，王珍，窦贵旺，钟望涛，吴志红.内皮素-1基因多态性与高血压缺血性卒中的关系[J].西南大学学报（自然科学版），2009，（第1期）：116-121

等位基因G和A在实验组的分布频率为211（70.3%）、89（29.7%），在对照组中的分布频率为430（69.1%）、192（30.9%），统计学分析结果显示组间也没有明显差异（P>0.05）。

表1两组患者基因型分布频率

基因型 实验组（例/率） 对照组（例/率）GG 79（52.7%） 159（51.1%）GA 53（35.3%） 112（36.0%）AA 17（11.3%） 40（12.9%）

表2两组患者等位基因分布频率

等位基因 实验组（例/率） 对照组（例/率）G 211（70.3%） 430（69.1%）A 88（29.7%） 192（30.9%）

3讨论

老龄化社会的到来使得老年性疾病的发生率逐日增高，脑梗死的三高的特点成为老年人身体健康的重要威胁因素，也是影响老年患者生存质量的重要因素，彻底破解脑梗死发生的原因是防治该病的必要前提。诸多研究从不同的角度对该病的发病原因进行了探讨，但到目前为止依然没有确切的答案。

内皮素对心血管系统的稳定性具有重要作用，而目前发现的三类内皮素中，内皮素-1被发现收缩功能最强。金启建等检测脑梗死病人ET-1的水平并与正常对照比较，研究结果显示脑梗死病人血清ET-1水平明显高于正常对照组。众多相关研究指向ET-1增高是脑梗死发病的内源性危险因素之一[6]。

我们对海南汉族人群中脑梗死和健康对照进行了比对研究，结果显示两组中均可检测出三种基因型GG、GA、AA，三种基因型在实验组中的分布频率为7979（52.7%）、53（35.3%）、18（12%），在对照组中的分布频率为159（51.1%）、112（36.0%）、40（12.9%）组间基因型分布频率均无明显差异（P>0.05）。等位基因G和A在实验组的分布频率为211（70.3%）、89（29.7%），在对照组中的分布频率为430（69.1%）、192（30.9%），统计学分析结果显示组间差异无显著（P>0.05）。以上研究结果说明，ET-1的Taq I位点多态性与海南汉族脑梗死疾病没有关联性。

参考文献

[1]Kevin M. Barrett； James F. Meschia. Cerebral infarction in older age. Neurology， 2012，79（15）：1524-1525

[2] Ueda N，Satoh S， Kuroiwa Y. Multiple cerebral infarction and cardiomyopathy with pheochromocytoma. The Neurologist，2011，17（1）：34-37

[3]杨发满.老年脑梗死患者血栓调节蛋白及IL-6水平[J].中国老年学杂志，2013，（第18期）：4573-4574

[4]李红娟，李庆.脑梗死患者相关危险因素分析[J].中国卫生检验杂志，2013，（第2期）.：487-488，491

[5]刘静波.急性脑梗死患者血浆内皮素表达水平的临床研究[J].中华全科医学，2013，（第8期）：1329-1240

[6]杭丽玮，周建中，王珍，窦贵旺，钟望涛，吴志红.内皮素-1基因多态性与高血压缺血性卒中的关系[J].西南大学学报（自然科学版），2009，（第1期）：116-121

等位基因G和A在实验组的分布频率为211（70.3%）、89（29.7%），在对照组中的分布频率为430（69.1%）、192（30.9%），统计学分析结果显示组间也没有明显差异（P>0.05）。

表1两组患者基因型分布频率

基因型 实验组（例/率） 对照组（例/率）GG 79（52.7%） 159（51.1%）GA 53（35.3%） 112（36.0%）AA 17（11.3%） 40（12.9%）

表2两组患者等位基因分布频率

等位基因 实验组（例/率） 对照组（例/率）G 211（70.3%） 430（69.1%）A 88（29.7%） 192（30.9%）

3讨论

老龄化社会的到来使得老年性疾病的发生率逐日增高，脑梗死的三高的特点成为老年人身体健康的重要威胁因素，也是影响老年患者生存质量的重要因素，彻底破解脑梗死发生的原因是防治该病的必要前提。诸多研究从不同的角度对该病的发病原因进行了探讨，但到目前为止依然没有确切的答案。

内皮素对心血管系统的稳定性具有重要作用，而目前发现的三类内皮素中，内皮素-1被发现收缩功能最强。金启建等检测脑梗死病人ET-1的水平并与正常对照比较，研究结果显示脑梗死病人血清ET-1水平明显高于正常对照组。众多相关研究指向ET-1增高是脑梗死发病的内源性危险因素之一[6]。

我们对海南汉族人群中脑梗死和健康对照进行了比对研究，结果显示两组中均可检测出三种基因型GG、GA、AA，三种基因型在实验组中的分布频率为7979（52.7%）、53（35.3%）、18（12%），在对照组中的分布频率为159（51.1%）、112（36.0%）、40（12.9%）组间基因型分布频率均无明显差异（P>0.05）。等位基因G和A在实验组的分布频率为211（70.3%）、89（29.7%），在对照组中的分布频率为430（69.1%）、192（30.9%），统计学分析结果显示组间差异无显著（P>0.05）。以上研究结果说明，ET-1的Taq I位点多态性与海南汉族脑梗死疾病没有关联性。

参考文献

[1]Kevin M. Barrett； James F. Meschia. Cerebral infarction in older age. Neurology， 2012，79（15）：1524-1525

[2] Ueda N，Satoh S， Kuroiwa Y. Multiple cerebral infarction and cardiomyopathy with pheochromocytoma. The Neurologist，2011，17（1）：34-37

[3]杨发满.老年脑梗死患者血栓调节蛋白及IL-6水平[J].中国老年学杂志，2013，（第18期）：4573-4574

[4]李红娟，李庆.脑梗死患者相关危险因素分析[J].中国卫生检验杂志，2013，（第2期）.：487-488，491

[5]刘静波.急性脑梗死患者血浆内皮素表达水平的临床研究[J].中华全科医学，2013，（第8期）：1329-1240

[6]杭丽玮，周建中，王珍，窦贵旺，钟望涛，吴志红.内皮素-1基因多态性与高血压缺血性卒中的关系[J].西南大学学报（自然科学版），2009，（第1期）：116-121