紫地榆的乙酸乙酯部分和水部分抗粘性放线菌的体外研究

杨 淋，王 涛，蓝 海*

（1.大理学院药学与化学学院，云南大理 671000；2.大理学院基础医学院，云南大理 671000）

紫地榆是牻牛儿苗科老鹳草属植物Geranium strictipesR.Kunth的根，其主要的化学成分有没食子酸、鞣花酸、原儿茶酸、五倍子酸甲酯、（+）-儿茶素、3，4-二羟基苯甲酸等〔1-3〕。张娴文等〔4-6〕通过紫地榆的体外抗菌实验证实紫地榆提取物具有良好的体外抗菌作用；蓝海等〔7〕通过紫地榆水提物对再矿化及抗酸脱矿作用的体外研究发现其抑制脱矿和促进再矿化方面效果明显；刁水全等〔8〕通过恒pH法比较牛切牙经紫地榆处理后抗酸脱矿作用发现100 g/L紫地榆对牙齿有保护作用，抗龋效果比氟化钠（20 mg/L）好，但紫地榆对口腔主要的致龋菌粘性放线菌生长、产酸及粘附的研究还未见报道。

1 材料

紫地榆购于大理药材市场，由大理学院药化学院杨月娥高级实验师鉴定为紫地榆Geranium strictipesR.Kunth 的根。粘性放线菌ATCC 27044（广东微生物菌种保藏中心）；胰酶解酪蛋白- 植物蛋白胨- 酵母提取物（trypticase-phytone-yeast extractm edium，TPY）固体及液体培养基；0.5、0.1 mol/L氢氧化钠；0.5 mol/L 磷酸盐（PBS）缓冲液、蔗糖、无水乙醇、葡萄糖、蒽酮、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇，以上试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 紫地榆粗提物的制备用95%乙醇常温浸泡粉碎的原药材24 h，抽滤后把滤液旋转蒸发成浸膏后加适量蒸馏水溶解，用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、蒸馏水萃取，所得的各部分冷冻干燥后得粉末备用。

2.2 菌液制备将粘性放线菌ATCC 27044冻干菌株复苏48 h 后接种于TPY 液体培养基中厌氧条件下（37 ℃ 、80%N2，20%CO2）培养18 h。经生化鉴定及涂片检查为纯培养后，将细菌接种在TPY 固体培养基上传代，用无菌棉签把TPY固体培养基上的二代菌落取出置于无菌生理盐水内，用0.5 麦氏单位标准比浊管调菌悬液的浓度，配成630 nm波长处菌液浓度光密度值（optical density，OD 值）约为0.1 的菌悬液备用。

2.3 最低抑菌浓度及最低杀菌浓度的测定测定紫地榆乙酸乙酯部分和水部分的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）及最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）。将紫地榆乙酸乙酯部分和水部分按2倍稀释法分别溶于含1%葡萄糖的TPY 液体培养基中，使其终浓度分别为72.000 g/L、36.000 g/L、18.000 g/L、9.000 g/L、4.500 g/L、2.250 g/L、1.125 g/L、0.563 g/L。将菌悬液与含药液的培养基按1:1（V/V）比例，加入96孔板后置37 ℃，80%N2，20%CO2下厌氧培养48 h。肉眼观察是否有菌生长，以无菌生长的紫地榆萃取物浓度为其MIC。选择大于MIC 浓度的各孔，分别取20 μL 涂布于TPY 固体培养基上，在相同条件下培养48 h，肉眼观察菌落数少于5～6个的最低萃取物浓度为最低杀菌浓度（MBC）〔9〕，实验重复3次。

2.4 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对粘性放线菌产酸作用的影响根据紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对上述粘性放线菌的MIC 测定结果，将含1%葡萄糖和紫地榆萃取物的TPY 液体培养基配成MIC以下浓度梯度的4个实验组，另设1个含0.05%洗必泰的阳性对照组、1个不含药物的阴性对照组，共6 组，每组设3 个平行管，实验重复3 次。调定初始pH 值为7.4 并按菌悬液：TPY 液体培养基为1:10（V/V）的比例接种粘性放线菌后置于37 ℃，80%N2，20%CO2厌氧条件下培养48 h。用pH 计测定培养物上清液的pH 值并计算pH 的变化值△pH（初始pH值-终末pH值）。

2.5 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对粘性放线菌粘附作用的影响采用2 倍稀释法将含5%蔗糖和含紫地榆萃取物的TPY 液体培养基配成MIC 以下4 个浓度梯度的实验组，另设1 个不含药液的阴性对照组和1 个含0.05%洗必泰的阳性对照组，每组3 个平行管。将菌悬液与药液按体积比1:10（V/V）接种，各试管混匀，置管与地平面呈30°倾斜，置于37 ℃，80% N2，20% CO2下厌氧培养48 h。将试管中液体轻轻移去，用磷酸盐缓冲液洗脱粘附到试管壁的细菌，3 mL/次，共3次，然后3 000 r/min 离心20 min，收集细菌置于2 mL 蒸馏水中，混匀。各试管均吸取200 μL 于96 孔板，用酶标仪测定630 nm波长处OD 值，重复测3 次，结果取平均值，并计算粘附抑制率。

粘附抑制率=（阴性对照组OD630nm- 实验组OD630nm）/阴性对照组OD630nm×100%

2.6 统计学分析采用SPSS 17.0 统计软件对数据（±s）进行分析，各组总体均数之间比较采用单因素方差分析（ANOV，analysis of variance）；两两比较用Dunnett T3检验，检验水准α=0.05。

3 结果

3.1 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对粘性放线菌生长的影响紫地榆乙酸乙酯部分对粘性放线菌的MIC和MBC分别为4.500 g/L，9.000 g/L。紫地榆水部分对粘性放线菌的MIC和MBC分别为9.000 g/L，18.000 g/L。

3.2 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对粘性放线菌产酸作用的影响各浓度组△pH 值不随紫地榆乙酸乙酯部分浓度的增加而逐渐减小。不同浓度紫地榆乙酸乙酯部分对粘性放线菌产酸作用的影响结果经单因素方差分析，各浓度组△pH值总体均数不全相等（F=795.801，P＜0.01），用Dunnett T3 进行两两比较。

随紫地榆水部分浓度的增加，4.500 g/L、2.250 g/L、1.1253 g/L3个实验组△pH值的变化不明显，任意两组间比较，差异不具有统计学意义（P≥0.05）。经单因素方差分析，各浓度组△pH值总体均数不全相等（F=2362.321，P＜0.01），用Dunnett T3进行两两比较。见表1及图1。

表1 不同浓度紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对粘性放线菌产酸作用的影响（±s）

表1 不同浓度紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对粘性放线菌产酸作用的影响（±s）

注：a表示与阴性对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；b 表示与阳性对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；c 表示任意两实验组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

乙酸乙酯部分浓度/（g/L）2.250 1.125 0.563 0.281阴性对照组阳性对照组△pH 值0.780 3±0.023 3a,b,c 0.878 6±0.033 8a,b,c 0.857 5±0.021 7a,b,c 1.098 9±0.058 9a,b,c 2.820 0±0.043 6 0.727 8±0.058 9水部分浓度/(g/L)4.500 2.250 1.125 0.563阴性对照组阳性对照组△pH 值0.620 3±0.036 5a,b 0.654 7±0.041 5a,b 0.641 9±0.038 0a,b 2.258 5±0.233 4b,c 2.703 1±0.175 6 0.725 5±0.058 3

图1 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分萃取物对粘性放线菌产酸作用的影响

3.3 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对粘性放线菌粘附作用的影响粘性放线菌的粘附抑制率随着紫地榆乙酸乙酯部分浓度的增大而增大。经单因素方差分析，各浓度组OD值总体均数不全相等（F=398.592，P＜0.01），用Dunnett T3 进行两两比较。粘性放线菌的粘附抑制率随着紫地榆水部分浓度的增大而增大。经单因素方差分析，各浓度组OD 值总体均数不全相等（F=171.199，P＜0.01），用Dunnett T3进行两两比较。见表2及图2。

图2 紫地榆乙酸乙酯部分和水部分萃取物对粘性放线菌粘附作用的影响

4 讨论

粘性放线菌是口腔中常见的革兰氏阳性菌，不仅能发酵多种碳水化合物产酸，而且对胶原也有很强的亲和力，在龋损根面菌斑中的代谢活性明显高于无龋根面菌斑，它与根面龋的发生有密切联系〔10〕。细菌对牙面的粘附、产酸和耐酸是粘性放线菌致病的主要表现，其中细菌的粘附性是最重要的毒力因子〔11〕。本实验中乙酸乙酯部分低于MIC的4个浓度梯度实验组（2.250 g/L、1.125 g/L、0.563 g/L、0.281 g/L）的△pH值与空白对照组的△pH值比较，4 个实验组的△pH 值差异均具有统计学意义（P＜0.05），说明紫地榆乙酸乙酯部分能明显抑制粘性放线菌产酸；4 个实验组的OD 值与空白对照组的OD值比较差异均具有统计学意义（P＜0.05），且其抑制作用随着紫地榆乙酸乙酯部分浓度的增加而明显增强，说明紫地榆乙酸乙酯部分能明显抑制粘性放线菌粘附；水部分低于MIC 的4 个浓度梯度实验组（4.500 g/L、2.250 g/L、1.125 g/L、0.563 g/L）的△pH值与空白对照组的△pH值比较，前3个实验组的△pH值差异均具有统计学意义（P＜0.05），说明一定浓度的紫地榆水部分能抑制粘性放线菌产酸；4 个实验组的OD 值与空白对照组的OD 值比较差异具有统计学意义（P＜0.05），且其抑制作用随着紫地榆水部分浓度的增加而明显增强，说明紫地榆水部分能明显抑制粘性放线菌粘附。

表2 不同浓度紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对粘性放线菌粘附作用的影响（±s）

表2 不同浓度紫地榆乙酸乙酯部分和水部分对粘性放线菌粘附作用的影响（±s）

注：a 表示与阴性对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；b 表示与阳性对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；c 表示任意两实验组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

乙酸乙酯部分浓度/（g/L）2.250 1.125 0.563 0.281阴性对照组阳性对照组OD 值0.138 0±0.018 3a,b 0.143 5±0.034 6a,b 0.184 2±0.028 5a,b,c 0.280 5±0.033 6a,b,c 0.397 5±0.041 6 0.054 9±0.011 5粘附抑制率/%65.29 63.90 53.65 29.44—86.85水部分浓度/(g/L)4.500 2.250 1.125 0.563空白对照组阳性对照组OD 值0.204 8±0.042 2a,b 0.233 0±0.048 8a,b 0.278 0±0.059 8a,b 0.334 0±0.044 8a,b,c 0.507 5±0.093 9 0.054 9±0.011 5粘附抑制率/%59.65 54.09 45.21 34.17—86.85

醋酸洗必泰又称醋酸氯已定（chlorhexidine acetate，CA），是一种广谱抗生素，能减少牙周病和龋病的发生。刘建宁等〔12〕研究证实洗必泰漱口液可以有效地控制菌斑，减轻牙龈炎的程度；薛丹等〔13〕研究发现洗必泰与壳聚糖合用可以发挥协同抑菌作用。本实验结果显示，紫地榆水部分浓度≥1.125 g/L时，其抑制粘性放线菌产酸的能力比0.05%的洗必泰强，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；紫地榆乙酸乙酯部分抑制粘性放线菌产酸的能力比0.05%的洗必泰弱，差异具有统计学意义（P＜0.05）；紫地榆乙酸乙酯部分和水部分抑制粘性放线菌粘附的能力均比0.05%的洗必泰弱。因洗必泰是一种有效的抗菌剂，广谱抗菌作用强，在短时间内能将细菌杀死，但其抗菌斑活性常因双胍活性基团位点被唾液或龈沟液中某些蛋白成分封闭而减低〔13〕，且长期使用会产生牙齿变色、味觉障碍等副作用，因此本研究为寻找副作用较轻的天然防龋药物打下基础。

综上所述，一定浓度的紫地榆乙酸乙酯部分和水部分萃取物可抑制粘性放线菌的生长、产酸和粘附作用，有望用于龋病的预防。

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