张元元,李耀康,王光明
(大理学院临床医学院,云南大理 671000)
同型半胱氨酸诱导基因(Homocysteine induced gene,HCY-2)是北京大学医学部心血管研究所在研究同型半胱氨酸处理血管平滑肌而克隆的新基因〔1-2〕,目前形态学研究证实HCY-2 表达广泛在成年大鼠的心脏、肾脏等组织中存在〔3〕,它在畸形人胚心脏中的表达发生异常〔4〕,而进一步研究显示在同型半胱氨酸诱导培养心肌细胞时,HCY-2的表达变化与细胞增殖改变密切相关〔5〕,但是HCY-2基因在呼吸系统中的表达以及HCY-2 基因表达异常与呼吸系统畸形的关系未见报道。为探讨该基因在人胚呼吸系统中的分布,我们探讨HCY-2在正常发育的人胚呼吸道中的表达变化,以揭示HCY-2基因在人呼吸系统发育中的作用。
1.1 材料HCY-2 抗体来源于北京大学医学部心血管研究所。正常人胚(以受精龄计算胎龄):4~8周人胚6例(早期),3~4月人胚5例(中期),5~6个月人胚5 例(晚期),8 月以上人胚4 例(近足月);以上人胚均取材自北京大学第三附属医院和平里医院等,所有胚胎因某种原因流产后均已死亡。
1.2 方法
1.2.1 人胚气管和肺的获得 取正常发育不同时期的气管和肺,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,以5 μm厚度进行组织切片。
1.2.2 免疫组织化学ABC 法 为显示正常发育人胚不同时期气管和肺内HCY-2的表达,按照免疫组织化学ABC 法进行染色。具体步骤:0.01 M KPBS清洗5 min×3 后;0.3%的过氧化氢甲醇溶液(甲醇80 mL+0.01 M KPBS 100 mL+30%过氧化氢)30 min,0.01 M PBS 清洗 5 min×3;0.3% Triton X100(30%Triton X100+0.01 M KPBS 100 mL)30 min,0.01 M KPBS 清洗 5 min×3;加入抗 HCY-2 抗体浓度为1:800(体积比),阴性对照组用PBS 代替抗HCY-2 抗体,4 ℃存放24 h;吸去抗体,0.01 M KPBS 洗5 min×3;加入0.01 M KPBS 稀释的二抗,室温孵育2 h,0.01 M KPBS 洗5 min×3;加入ABC 复合物抗体,室温孵育2 h,0.01 M KPBS 洗5 min×3;蒸馏水迅速冲3 次;加入显色液,进行免疫组织化学显色;梯度酒精脱水之后,封片。
1.2.3 HCY-2 表达的半定量分析及统计学处理用Q-500 图像分析系统检测HCY-2 在正常发育不同时期的人胚气管和肺中的表达变化灰度值,同时测定本底值,然后换算为光密度值(OD)。每个样本分析3 张切片,每张切片随机随机选取3 个视野进行分析。各组的HCY-2 表达用(±s)表示。首先用SPSS10.0统计软件中的One-way ANOVA 模块进行分析,有统计学意义后再用Scheffle post hoc 进行组间处理。P<0.05认为差异具有统计学意义。
2.1 HCY-2在胚胎时期肺内的表达同型半胱氨酸诱导基因在人体胚胎肺发育的整个时期均有表达,其阳性产物分布于肺和各级支气管的上皮及其气管腺的腺上皮细胞的细胞浆内。见表1及图1。根据阳性反应强度不同而呈浅黄色、黄色或者是深棕色,HCY-2在妊娠早期和妊娠中期的表达最强,见图1A及图1B,然后在妊娠晚期的表达下降,见图1C,在近足月的人胚肺内表达最弱,见图1D,妊娠晚期和近足月组与妊娠早期和中期比较,组间两两比较差异均具有统计学意义(P=0.000 01),近足月组与妊娠晚期组比较,差异具有统计学意义(P=0.000 01)。
表1 正常人胚肺内HCY-2免疫反应阳性物含量(±s)
表1 正常人胚肺内HCY-2免疫反应阳性物含量(±s)
注:与妊娠早期和中期比较**P<0.01;与妊娠晚期比较$$P<0.01。
发育不同时期妊娠早期妊娠中期妊娠晚期近足月切片数18 15 15 12检测单位面积54 45 45 36 HCY-2/单位面积0.389±0.028 0.395±0.029 0.215±0.039**0.174±0.037**,$$
图1 妊娠期肺内HCY-2的表达
2.2 HCY-2在胚胎时期气管中的表达HCY-2在人体胚胎气管发育的整个时期均有表达,其阳性产物主要分布于气管上皮和气管腺腺细胞的胞浆内,以及气管管壁内的透明软骨中软骨细胞的细胞核内。见表2 及图2)。根据阳性反应强度不同,HCY-2在近足月胚胎的气管中表达最强,见图2D,然后在妊娠早期和晚期的表达逐渐下降见图2B及图2C,在妊娠中期的人胚气管中表达最弱,见图2B,与妊娠早期比较,组间两两比较差异均具有统计学意义(P=0.00),与妊娠中期比较,差异均具有统计学意义(P=0.00),近足月组与妊娠晚期组比较差异有统计学意义(P=0.00)。
表2 正常人胚气管内HCY-2免疫反应阳性物含量(±s)
表2 正常人胚气管内HCY-2免疫反应阳性物含量(±s)
注:与妊娠早期比较**P<0.01;与妊娠中期比较$$P<0.01;与妊娠晚期比较##P<0.01。
发育不同时期妊娠早期妊娠中期妊娠晚期近足月切片数18 15 15 12检测单位面积54 45 45 36 HCY-2/单位面积0.301±0.029 0.219±0.029**0.251±0.032**,$$0.344±0.027**,$$,##
图2 妊娠期气管内HCY-2的表达(10×10)
HCY-2 是北京大学医学部心血管研究所在高浓度的同型半胱氨酸诱导下从大鼠血管平滑肌细胞中克隆出的 4 个新的 cDNA 序列之一〔1〕。研究发现该基因与细胞凋亡密切相关,属于凋亡基因〔6〕。HCY-2在成年大鼠的心脏、血管、肝、肺、肾脏、脊髓和脑组织中均表达〔3〕,并且在人体胚胎心脏发育的整个时期持续表达〔4〕,但是在胚胎发育时期除心脏外的其他脏器中是否表达以及是否具有作用还有待进一步探讨。
在该研究中,HCY-2在人胚气管和肺发育的整个过程中持续表达,并且其表达部位主要为气管及各级支气管的上皮和腺上皮。李英等〔3〕研究发现,HCY-2 在功能活跃或者增殖分裂能力强的细胞中高表达。而我们先前的研究结果也显示,心肌细胞内HCY-2的表达与心肌细胞的增殖呈正相关,当在心肌细胞中HCY-2高表达时,心肌细胞的增殖率随着HCY-2表达增高而升高,从而促进心肌细胞的生长和增殖;当HCY-2 低表达时,心肌细胞的生长率与HCY-2 的表达情况呈负相关〔5〕。在人胚气管和肺等发育过程中,构成气管和肺的主要细胞数量逐渐增多时,与之相对应的是HCY-2持续表达。因此可以推测在人胚呼吸系统发育过程中,HCY-2 的表达与组成呼吸系统的主要组成细胞的生长和增殖有关;HCY-2通过调节细胞的增殖来参与气管和肺的发育。
在鸡胚转HCY-2 基因研究时发现,HCY-2 基因高表达与鸡胚心室、心房发育、心脏结构紊乱、心内膜垫缺损以及心脏组成的主要细胞心肌细胞的超微结构改变密切相关〔7-9〕;在培养的人胚心肌细胞中的研究表明,HCY-2基因的表达改变可引起心肌细胞超微结构发生改变〔10〕。HCY-2 基因的异常表达可以引起鸡胚包括异位心和心脏过小等的心血管系统发育异常,因此推测HCY-2是一种导致胚胎发育异常的毒性因子。在内皮细胞内转染HCY-2基因,发现HCY-2 可以促进内皮细胞凋亡,而细胞凋亡在胚胎发育的整个过程中具有十分重要的作用〔11-12〕。因此进一步推测HCY-2 的表达蛋白通过引起细胞凋亡调节气管和肺的发育。
陈光慧等〔6〕研究表明,HCY-2 是一个凋亡促进基因,可以促进心肌细胞发生凋亡。在我们前期的研究中,HCY-2在室间隔膜部缺损的人胚心脏中表达明显高于正常发育的人胚心脏〔4〕,推测在心脏发育过程中HCY-2 基因通过调控细胞凋亡来影响心脏内部的分隔。基因数据库比对研究发现HCY-2 基因与 RIP3 基因高度同源〔10〕,为 RIP3 的同源基因。RIP3基因通过激活caspase-2以引发一系列的级联反应,从而导致细胞的凋亡〔13〕。在Hela 细胞中对RIP3进行基因沉默,第二信使cAMP和cGMP将不能够被激活,从而使细胞的信号传导途径受阻,细胞失去正常的功能〔14-15〕。在人胚气管和肺的发育中,HCY-2 的表达分别在近足月和妊娠早中期表达最高,而此时胚胎的气管和肺的发育活跃,组织结构改变明显,而在妊娠中期和近足月表达最低,这个时期胚胎的气管和肺的发育相对平稳,因此HCY-2在人体胚胎气管和肺的发育过程中,气管和肺的正常结构形成方面具有重要的作用,但是其具体作用机制还有待进一步研究。首先需要获得气管和肺畸形的胚胎,以研究HCY-2 的表达改变;另外在动物水平通过分子生物学技术使HCY-2 基因表达缺失来研究气管和肺的发育,这样才能够完全阐明HCY-2在胚胎气管和肺的发育中的作用及其机制。
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