肝龙胶囊及美洲大蠊脱脂膏对小鼠急性结肠炎的影响

牛春丽，曾 菁，夏盟恺，彭 芳

（大理学院药学与化学学院，云南大理 671000）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是炎症性肠病中的一种，迄今为止UC 的病因、机制仍未明确，可能与遗传、免疫、感染、精神心理等因素有关，UC 的治疗主要在于炎症的控制，目前临床常用的药物多依赖氨基水杨酸类、肾上腺皮质激素等对机体不良反应多的药物，现有药物的不良反应表现为易出现肝肾毒性，极易产生耐药性及潜在致畸等。随着中药研究的进一步发展，中药治疗UC 发挥着越来越重要的作用，康复新液作为美洲大蠊干燥虫体的乙醇提取物在以往的研究中对UC的作用已得到了肯定〔1-3〕，本研究立足美洲大蠊的另外制品，旨在进一步开发出更多对UC高效低毒的药物。本实验研究的肝龙胶囊是采用现代提取分离技术所获得的美洲大蠊另一有效成分，为了探讨此有效成分在消化系统方面是否有效果，所以本实验观察了其对动物性结肠炎的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物BALB/C小鼠购自重庆腾鑫科技有限公司，雌雄各半，体重18～22 g，合格证号：SCXK（渝）2012-0003。

1.2 受试药品及试剂肝龙胶囊（赛诺制药公司，批号：国药准字Z20050113）；康复新液（赛诺制药公司，批号：国药准字Z53020054）；美洲大蠊脱脂膏（由大理学院药学与化学学院刘光明教授提供，批号：20110906）。葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS，MP Biomedicals生产，合格号：0216011080）；髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）试剂盒（南京建成生物工程研究所生产，批号：20131018）；α-肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）免疫组化试剂盒（中杉金桥生物公司，批号：20110801）；生理盐水（normal saline，NS）（昆明南疆制药有限公司生产，批号：200803156）。

1.3 实验方法

1.3.1 分组及实验方法 将90只小鼠随机分为正常对照组，模型组，阳性对照组（康复新液0.36 mg/kg），肝龙胶囊高剂量组（100 mg/kg）、中剂量组（50 mg/kg）、低剂量组（25 mg/kg）；美洲大蠊脱脂膏高剂量组（200 mg/kg）、中剂量组（100mg/kg）、低剂量组（50mg/kg）。除正常组之外，其它组都给予3%DSS溶液自由饮用10 d〔4-6〕。饮用3%DSS第1天起，阳性对照组、肝龙胶囊组和美洲大蠊脱脂膏组按0.2 mL/10 g灌胃给药，1 次/d，连续10 d。模型组和正常对照组按0.2 mL/10 g灌胃NS，1 次／d，连续10 d。以上各组动物均置于代谢笼内饲养每天观察并记录小鼠体重、大便性状、皮毛及精神状态等，并计算疾病活动指数（disease activity index ，DAI）〔7〕。实验第10 天给药后3 h处死小鼠，取结肠远端距肛门4 cm 至回盲部肠段，观察并记录所得结肠长度，沿肠系膜缘纵行剖开，称取乙状结肠段粘膜50 mg，将小鼠结肠组织在冰浴下制成5%匀浆（或-80 ℃保存，备用），按MPO试剂盒说明测定其含量。留取剩余结肠标本（2 mm×10 mm），20%甲醛固定，常规石蜡包埋、切片、HE 染色。结肠组织TNF-α的检测采用免疫组化法检测〔8-10〕。DAI评分标准见表1。

表1 DAI评分标准

1.3.2 免疫组化图像分析法 平均光密度是医学图像分析中的一个重要指标，在离散图像中每一个小区域由一个样本点表示，每一个样本点被称为一个像素，每一个像素的明亮程度即代表这个区域的平均灰度，被称为像素的平均灰度。在医学图像定量分析中常用平均光密度来表示，平均光密度与平均灰度之间可用公式计算〔11-12〕。免疫组化切片中阳性区的表达的强弱与光密度值呈正相关，与灰度值呈负相关。使用Image J图像分析软件，打开所需分析的免疫组化图片，在Analyze 菜单中选取Set Measurements，从中选择平均灰度，对选择的阳性染色区域进行测定，结果直接登录到Excel表中，进行计算得出平均光密度值后统计分析。计算公式为：

OD:平均光密度；Io:入射光强度，空白视野的平均灰度值；Ii:透射光强度，被测物体的平均灰度值。

2 结果

2.1 肝龙胶囊及美洲大蠊脱脂膏对小鼠急性结肠炎结肠长度的影响由表2 可见，对小鼠结肠长度的影响：所有饮用3%DSS的各组小鼠结肠长度都出现了不同程度的缩短，与NS组比较，模型组缩短最多（P＜0.01），美洲大蠊脱脂膏3 个剂量组，肝龙胶囊低剂量组显著性缩短（P＜0.01），肝龙胶囊中剂量组缩短较少（P＜0.05），肝龙胶囊高剂量组，康复新液组与NS组比较缩短差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，NS 组，康复新液组，肝龙胶囊高、中剂量组显著性增长（P＜0.01），美洲大蠊脱脂膏低剂量组增长较少（P＜0.05）；与康复新液组比较，模型组，美洲大蠊脱脂膏高剂量及中剂量组显著性缩短（P＜0.01），肝龙胶囊低剂量组缩短较少（P＜0.05），肝龙胶囊高、中剂量组，美洲大蠊脱脂膏低剂量组与康复新液组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 肝龙胶囊及美洲大蠊脱脂膏对小鼠急性结肠炎结肠长度的影响（±s，n=10）

表2 肝龙胶囊及美洲大蠊脱脂膏对小鼠急性结肠炎结肠长度的影响（±s，n=10）

注:与NS 组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与阳性组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别NS模型组肝龙胶囊高剂量组肝龙胶囊中剂量组肝龙胶囊低剂量组美洲大蠊脱脂膏高剂量组美洲大蠊脱脂膏中剂量组美洲大蠊脱脂膏低剂量组康复新液剂量/（mg/kg）100.00 50.00 25.00 200.00 100.00 50.00 0.36结肠长度/cm 6.22±0.66(正常)4.36±0.40**△△5.59±0.42##5.48±0.88*##4.99±0.70**△4.41±0.49**△△4.65±0.75**△△5.09±0.39**#5.69±0.98##

2.2 肝龙胶囊及美洲大蠊脱脂膏对小鼠急性结肠炎DAI 的影响由表3 可见，肝龙胶囊对小鼠DAI的影响：与NS组比较，饮用3%DSS各组都有不同程度的增大，其中模型组增大最多（P＜0.01），肝龙胶囊3 个剂量组、美洲大蠊脱脂膏3 个剂量组显著性增大（P＜0.01），康复新液组与NS 组比较差异无统计学意义（P ＞0.05）；与模型组比较，各组DAI 显著性增大（P＜0.01）；与康复新液组比较，模型组，肝龙胶囊中、低剂量组及美洲大蠊脱脂膏中、低剂量组显著性增大（P＜0.01），肝龙胶囊高剂量组增大较少（P＜0.05），美洲大蠊脱脂膏高剂量组与康复新液组比较差异无统计学意义（P ＞0.05）。DAI 描述的是体重下降、稀便、大便隐血3 种结肠炎炎症活动的活跃情况，所以DAI 值的大小与结肠炎严重程度呈正相关。

表3 肝龙胶囊及美洲大蠊脱脂膏对小鼠急性结肠炎DAI的影响（±s，n=10）

表3 肝龙胶囊及美洲大蠊脱脂膏对小鼠急性结肠炎DAI的影响（±s，n=10）

注: 与 NS 组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与阳性组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别NS模型组肝龙胶囊高剂量组肝龙胶囊中剂量组肝龙胶囊低剂量组美洲大蠊脱脂膏高剂量组美洲大蠊脱脂膏中剂量组美洲大蠊脱脂膏低剂量组康复新液剂量/（mg/Kg）100.00 50.00 25.00 200.00 100.00 50.00 0.36 DAI 0.57±0.19 3.47±0.40**△△1.47±0.60**##△2.20±0.52**##△△2.24±0.67**##△△1.37±0.50**##2.10±0.43**##△△2.27±0.54**##△△0.93±0.68##

2.3 肝龙胶囊及美洲大蠊脱脂膏对小鼠急性结肠炎MPO含量的影响由表4可见，对小鼠MPO含量的影响：与NS 组比较，模型组增加显著（P＜0.01），美洲大蠊脱脂膏、肝龙胶囊各剂量组、康复新液组MPO 含量与NS 比较差异都没有统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，肝龙胶囊高剂量组MPO 含量显著性减少（P＜0.01），肝龙胶囊中、低剂量组，美洲大蠊脱脂膏中剂量组及康复新液组MPO 含量减少（P＜0.05），美洲大蠊脱脂膏高、低剂量组与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与康复新液组比较，只有模型组MPO 含量增加（P＜0.05）。美洲大蠊脱脂膏各剂量组未出现明显的药物浓度依赖性。

表4 肝龙胶囊及美洲大蠊脱脂膏对小鼠急性结肠炎MPO含量的影响（±s，n=10）

表4 肝龙胶囊及美洲大蠊脱脂膏对小鼠急性结肠炎MPO含量的影响（±s，n=10）

注:与NS 组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与阳性组比较，△P＜0.05。

组别NS模型组肝龙胶囊高剂量组肝龙胶囊中剂量组肝龙胶囊低剂量组美洲大蠊脱脂膏高剂量组美洲大蠊脱脂膏中剂量组美洲大蠊脱脂膏低剂量组康复新液剂量/（mg/kg）100.00 50.00 25.00 200.00 100.00 50.00 0.36 MPO 含量/（U/g）0.26±0.12 0.86±0.38**△0.38±0.19##0.45±0.25#0.51±0.16#0.52±0.15 0.44±0.24#0.55±0.21 0.52±0.17#

2.4 肝龙胶囊及美洲大蠊脱脂膏对小鼠急性结肠炎组织病理学的影响由图1可见：饮用3%DSS各组小鼠病理学检查都出现了不同程度的炎性细胞浸润以及腺体消失等现象，其中模型组炎性细胞浸润明显、也出现了大量的腺体、空杯细胞消失，而各药物组的UC 现象都得到了一定的改善，其中肝龙胶囊高剂量组、美洲大蠊脱脂膏低剂量组和康复新液组都保持了较为完整结肠结构。

图1 肝龙胶囊及美洲大蠊脱脂膏对小鼠急性结肠炎组织病理学的影响

2.5 肝龙胶囊及美洲大蠊脱脂膏对小鼠急性结肠炎TNF-α免疫组化的影响将各组解剖所得结肠段用20%甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，用TNF-α免疫组化试剂盒对切片进行脱蜡、显色，以观察各组TNF-α表达量。

TNF-α阳性表达一般发生在细胞浆，颜色因表达强度由弱至强呈浅黄至深褐色。由图2 可见：整个视野细胞浆呈深褐色，表现出较强的阳性表达，NS 组整个视野细胞浆呈蓝色，未见阳性表达，而其它各组阳性面积较模型组比较都大大缩小，且颜色深度亦较浅。美洲大蠊、肝龙胶囊各剂量组和康复新液组都表现出了不同的阳性率。运用Image J 软件法对每组切片的阳性表达区域进行测定得出其平均灰度值，并进行计算得到平均光密度值，平均光密度值与TNF-α表达强度呈正相关。见表5。

图2 肝龙胶囊及美洲大蠊脱脂膏对小鼠急性结肠炎TNF-α的影响

由表5 可见，对小鼠TNF-α免疫组化平均光密度的影响：与NS 组比较，模型组增加最多（P＜0.01），肝龙胶囊高、中剂量组和美洲大蠊脱脂膏低剂量组显著性增加（P＜0.01），康复新液组，美洲大蠊高、中剂量组及肝龙胶囊低剂量组与NS 组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，各组平均光密度都显著性减小（P＜0.01）；与康复新液组比较，只有模型组显著性增加（P＜0.01）。

表5 肝龙胶囊及美洲大蠊脱脂膏对小鼠急性结肠炎TNF-α免疫组化平均光密度的影响（±s，n=10）

表5 肝龙胶囊及美洲大蠊脱脂膏对小鼠急性结肠炎TNF-α免疫组化平均光密度的影响（±s，n=10）

注:与NS 组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01；与阳性组比较，△△P＜0.01。

组别NS模型组肝龙胶囊高剂量组肝龙胶囊中剂量组肝龙胶囊低剂量组美洲大蠊脱脂膏高剂量组美洲大蠊脱脂膏中剂量组美洲大蠊脱脂膏低剂量组康复新液剂量（mg/Kg）100 50 25 200 100 50 0.36平均光密度0.018±0.002 0.107±0.043**△△0.044±0.013**##0.048±0.008**##0.034±0.009##0.037±0.009##0.036±0.005##0.045±0.017**##0.034±0.012##

3 讨论

本研究结果提示，肝龙胶囊、美洲大蠊脱脂膏对于DSS 所致小鼠急性UC 有一定的粘膜保护作用。与模型组比较，肝龙胶囊组、美洲大蠊脱脂膏组结肠长度增长，表明肝龙胶囊、美洲大蠊脱脂膏能减轻结肠粘膜破损、固有结构丧失以及瘢痕生成等UC 炎症反应，保护小鼠结肠粘膜；与模型组比较，肝龙胶囊组、美洲大蠊脱脂膏组DAI 显著性减小（P＜0.01），表明肝龙胶囊、美洲大蠊脱脂膏能减轻UC 症状的严重程度。MPO 含量检测中，美洲大蠊脱脂膏、肝龙胶囊各剂量组与康复新液组比较不存在统计学意义，且出现了表达量低于康复新液组的趋势。在TNF-α免疫组化检查中，美洲大蠊脱脂膏、肝龙胶囊各剂量组与康复新液组平均光密度比较亦不存在统计学意义，这说明美洲大蠊脱脂膏、肝龙胶囊各剂量组TNF-α表达强度与康复新液组相当，表明美洲大蠊脱脂膏、肝龙胶囊各剂量组对急性UC 可能产生了与康复新液组相当的改善作用。由实验结果推测，肝龙胶囊、美洲大蠊脱脂膏对DSS所致小鼠急性UC的保护作用可能与抑制中性粒细胞MPO 的释放和降低结肠组织中TNF-α表达量有关。

UC 的病理改变主要表现为固有膜内弥漫性炎性细胞浸润，而急性UC主要为中性粒细胞浸润，另外可见腺体、杯状细胞减少等现象。通过本实验的病理切片观察，模型组小鼠的病理组织切片出现弥漫性的炎性细胞浸润，且固有的结构破坏；阳性药及其它各给药组粘膜炎性细胞与模型组比较浸润程度不同程度地减少，排列紧密，且结构基本保持完整。肝龙胶囊、美洲大蠊脱脂膏对DSS所致急性UC 有一定的保护作用，其作用可能与抑制中性粒细胞MPO 的释放和降低结肠组织中TNF-α含量有关。本次实验结果为以美洲大蠊为原料的药品治疗急性UC提供了一定的理论依据。

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