ApoG2联合放疗对鼻咽癌CNE-2细胞自噬 与凋亡的影响研究

刘洋，刘硕，孙建军



论著·基础

ApoG2联合放疗对鼻咽癌CNE-2细胞自噬 与凋亡的影响研究

刘洋，刘硕，孙建军

目的 探讨ApoG2联合放射治疗对鼻咽癌(NPC)的CNE-2细胞自噬与凋亡的影响。方法 将人NPCCNE-2细胞株分成空白对照组(仅加培养液，不加细胞)、放射治疗组、ApoG2组、联合组(放射+ApoG2)，采用CCK-8法测定ApoG2+放射治疗对细胞增敏的作用，Hoechst33258染色观察细胞凋亡形态的变化，吖啶橙染色观察细胞自噬形态变化，检测细胞凋亡率的变化；Westernbolt检测Beclin1、Bcl-2蛋白的表达情况变化。结果 不同的放射剂量组间细胞增殖抑制率比较具有显著性差异(P<0.01)，随着放射剂量的增加，鼻咽癌CNE-2细胞的抑制率也随之上升；不同的ApoG2药物浓度组间细胞增殖抑制率比较差异也具有显著性意义(P<0.01)，随着药物浓度的增加，鼻烟癌CNE-2细胞的抑制率也上升。4组CNE-2细胞的凋亡率组间比较具有显著性差异，联合组凋亡率显著高于其他3组(F=140.2，P<0.01)。4组的Bcl-2、Beclin1的蛋白表达量组间比较差异具有统计学意义(Bel-2：F=71.24，P<0.01；Beclinl：F=107.53，P<0.01)，其中联合组的Bcl-2蛋白表达量最低，Beclin1的蛋白表达量最高。结论ApoG2联合放疗能够通过诱导鼻咽癌CNE-2细胞的自噬与凋亡，从而抑制CNE-2细胞的增殖。

ApoG2；鼻咽癌；CNE-2细胞；自噬；凋亡

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.04.016

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是发生于上咽喉部或鼻咽腔的一种恶性肿瘤，对我国人民的生命健康构成了严重的威胁。由于其解剖学特点和生物学行为比较特殊，对放射线较为敏感，故其主要的治疗手段是放射治疗[1，2]。化疗药物大多数是通过对肿瘤细胞进行诱导使其发生凋亡达到治疗肿瘤的目的，目前有研究显示在治疗肿瘤的过程中自噬也扮演着重要的角色[3]。ApoG2(apogossyplone)作为小分子B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma，Bcl-2)的抑制剂，是新型的棉酚衍生物之一，在多种肿瘤的治疗中表现出了良好的治疗效果[4]。本文旨在通过对ApoG2联合放射治疗对NPC的CNE-2细胞增殖的抑制作用，探讨此种治疗手段对细胞自噬与凋亡的影响，给临床治疗NPC提供一种新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 人NPC CNE-2细胞株： 由中国医科大学肿瘤研究所提供。将人NPC CNE-2细胞株分成空白对照组(仅加培养液，不加细胞)、放射治疗组、ApoG2组、联合组(放射+ ApoG2)。

1.1.2 主要试剂： ApoG2(美国密歇根大学医学院)配成20 mmol/L母液于-20℃中避光保存，25 cm2和75 cm2的培养瓶，6、9孔板，15 ml和50 ml的离心管(Corning公司)，PBS溶液、0.25%胰蛋白酶溶液(含EDTA)(HyClon公司)，H-DMEM高糖培养液(HyClon公司)，胎牛牛血清(杭州四季青公司)，1×青链霉素(广州捷倍斯生物科技有限公司)，Hoechst 33258染色试剂盒、CCK-8溶液(碧云天生物技术有限公司)，细胞凋亡试剂盒(南京凯基生物产品)，BCA、PMSF、RIPA蛋白定量试剂盒(上海申能博彩生物公司)，预染蛋白Marker(Fermentas公司)，5×上样缓冲液(碧云天生物技术有限公司)，beta-actin(上海艾比玛特公司)，抗Bcl-2抗体、抗Beclin1抗体(Santa Cruz公司)，辣根过氧化物酶二抗(武汉博士德公司)，PVDF膜(Millipore公司，美国)，ECL发光液(碧云天生物技术有限公司)。

1.1.3 主要设备： X胶片(柯达公司)，定影粉、显影粉(广州威佳科技有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养： (1)细胞复苏。解冻人NPC CNE-2细胞株冻存管，移至无菌操作台，将细胞放置离心管内，注入5 ml含1×青链霉素、10%灭活胎牛血清的H-DMEM培养液内，将细胞轻轻吹打和洗涤，离心后将废液除去；重悬细胞后移入培养瓶内，放置于培养箱内培养。(2)细胞的传代和培养。对人NPC CNE-2细胞的贴壁情况进行观察，每3天换1次液，若培养瓶底80%～90%被细胞长满时进行传代培养，即先将培养液吸去，洗涤后加入0.25%的胰蛋白酶溶液(含EDTA)，将瓶底铺满，在培养箱内孵育、消化5～7 min，取出置于显微镜下，对细胞形态进行详细观察。大量细胞一旦变圆时，为了终止细胞消化注入培养液，然后将细胞悬液离心，除去废液，重悬细胞，最后按照1∶4～1∶5进行细胞的传代处理。

1.2.2 细胞增殖抑制测试： 采用CCK-8法测定,消化对数生长期细胞CNE-2，计数后重悬细胞，接种于96孔的培养板，消化后将细胞浓度调整为5×104个/ml，接孔，每孔注入100 μl的细胞悬液。培养后将旧培养液吸尽，分成空白对照组(仅加培养液，不加细胞)、放射治疗组、ApoG2组、联合组(放射+ ApoG2)，每组平行复孔4个。分别培养后将旧培养液吸尽，将新培养液注入，同时注入10 μl的CCK-8溶液，于培养箱内孵育。在450 nm波长下用酶标仪测定各孔的吸光度A值，反复3次，依据抑制率(%)=1-(实验组平均A值-空白对照组的A值)/(对照组平均A值-空白对照组的A值)×100%，计算各组的增殖抑制率。

1.2.3 观察细胞凋亡、自噬形态变化： Hoechst 33258染色观察联合治疗下细胞凋亡形态的变化和吖啶橙染色对联合治疗下细胞自噬形态的变化。消化、重悬对数生长期细胞CNE-2，计数后依据1.5×105个/孔接种至6孔板中，培养瓶底长满50%～70%的细胞后将旧培养液吸尽，分为对照组(0.01%DMSO)，放射治疗组(4 Gy)，ApoG2组(20 μmol/L)，联合组(放射治疗+ApoG2)。将100 μl的培养液加入每组中，联合组及放射治疗组照射4 Gy。培养后将旧培养液吸尽，加入固定液0.5 ml，均匀覆盖孔板底，洗涤后将废液吸尽，加入Hoechst 33258染色液0.5 ml/1.0 mg-1·L-1吖啶橙染色，避光5 min/15 min后将废液吸尽，在阴凉避光下保存，反复3次于显微镜下观察细胞凋亡的形态。

1.2.4 Western bolt蛋白印迹法检测联合治疗下Beclin 1、Bcl-2蛋白的表达变化： 依据上述的分组情况，待培养瓶底长满50%～70%的细胞后将旧培养液吸尽，将100 μl的培养液加入每组中，联合组及放射治疗组照射4 Gy。培养、收集以及冰上裂解细胞后，将总蛋白收集，采用BCA法测定蛋白的浓度。用12%的SDS-PACE将蛋白分离，15 V半干转膜仪，1 h后转至PVDF上，封闭1 h后洗膜，加入已经稀释过的Bcl-2、Beclin1、β-actin多克隆抗体，再次封闭、洗膜，用稀释过的辣根过氧化物酶二抗进行1 h的反应后洗膜，显影定影后，分析结果。

2 结 果

2.1 各组鼻咽癌CNE-2细胞增殖抑制率的比较 不同的放射剂量组间比较差异具有统计学意义(P<0.01)，随着放射剂量的增加，鼻咽癌CNE-2细胞抑制率也随之上升。不同的ApoG2药物浓度组间比较差异也具有统计学意义(P<0.01)，随着ApoG2浓度逐渐增加，鼻咽癌CNE-2细胞抑制率也随之升高。见表1。

表1 ApoG2联合放疗对于CNE-2的生长抑制率 (%)

2.2 各组鼻咽癌CNE-2细胞凋亡率的比较 结果提示4组CNE-2细胞的凋亡率组间比较差异具有统计学意义(F=140.2，P<0.01)，联合组CNE-2细胞凋亡率显著高于其他3组(P<0.01)。见表2。

表2 各组鼻咽癌CNE-2细胞凋亡和自噬的比较±s)

2.3 各组细胞自噬的比较 各组的Bcl-2、Beclin1的蛋白表达量组间比较差异具有统计学意义(F=71.24，F=107.53，P均<0.01)，其中联合组的Bcl-2蛋白表达量最低，Beclin1的蛋白表达量最高。见表2，图1。

图1 各组Bcl-2、Beclin 1及β-actin蛋白表达比较

3 讨 论

据相关研究资料显示，细胞自噬和凋亡间的相互作用能共同对细胞的死亡起促进作用。Bcl-2蛋白是对细胞凋亡起主要调控作用的蛋白，其过表达可以对细胞自噬的发生起有效地抑制作用[5]。其既可以对凋亡进行诱导，也能对自噬构成影响。其中Bcl-2蛋白引发的自噬与Beclin1蛋白可能相关。Beclin1蛋白存在BH3的结构域，类似BH3的物质可以竞争性地对抗Bcl-2与Beclin间的结合，可以释放出Beclin1来促进细胞的自噬。Bcl-2与Beclin间的结合能对乳腺癌细胞株MCF-7细胞具有的自噬能力进行有效的抑制，但是突变型的Beclin1无法与Bcl-2蛋白结合，增强了细胞的自噬，加快了细胞的凋亡过程[6，7]。

本研究结果发现，在体外运用ApoG2作用于NCLCNE-2细胞后，可以对细胞的生长进行有效地抑制，明显表现为剂量—时间的依赖性，抑制作用随着剂量的上升而增强，随着作用时间的延长而增强。此外体内试验结果也显示，当注射ApoG2第12天时将试验终止，肿瘤剥离，肿瘤称量结果提示肿瘤受到明显的抑制，提示无论体内还是体外应用ApoG2均可以对NCLCNE-2细胞有显著的抑制效果[8]。

本实验通过蛋白印迹法发现ApoG2可以引发Bcl-2表达的下调，进而诱导CNE-2细胞的凋亡，同时上调的Beclin1引发了自噬[9]，此与上述的结果相符。本实验结果表明，对于CNE-2细胞，放射治疗与ApoG2以及其联合作用，不同放射剂量间的比较具有显著的统计学差异，其对NPCCNE-2细胞的抑制率随着放射剂量的上升而上升。ApoG2的药物浓度不同，其之间的差异同样具有统计学意义，对应的抑制率也随着ApoG2药物浓度的增加而上升[10]。这2个结果间有着一定的交互效应，即在放射剂量不同的情况下，抑制率随着ApoG2药物浓度的增加而增强[11]；在ApoG2药物浓度不同的情况下，抑制率同样随着放射剂量的上升而增强。ApoG2是能够对肿瘤进行有效抑制的一种药物。通过蛋白印迹法发现Bcl-2蛋白的相对表达率有所降低，其中联合组的表达量最低；Beclin1蛋白的相对表达量上升，而联合组中最高。ApoG2可以促进放疗治疗对NCL的敏感性，可能的机制与下调的Bcl-2蛋白表达对细胞凋亡进行诱导，上调的Beclin1蛋白对细胞自噬进行诱导相关。在细胞的凋亡与自噬中，Beclin1蛋白起着重要的作用，其存在BH3结构域，类似BH3的物质可以竞争性地对抗Bcl-2与Beclin1的结合[12]。

总之，ApoG2可以协同增加放射治疗对NCL的敏感性，对NCL的生长进行有效地抑制，通过上调Beclin1蛋白的表达量以及下调Bcl-2蛋白的表达量对细胞的自噬与凋亡进行诱导，最终致使细胞死亡。

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The study of the effect of ApoG2 combined with radiotherapy onautophagy and apoptosis of CNE 2 cells of nasopharyngeal carcinoma

LIUYang,LIUShuo,SUNJianjun.

DepartmentofENT,theGeneralNavyHospital,Beijing100048,China

SUNJianjun,E-mail:jjsun85@sina.com

Objective To investigate the effect of ApoG2 combined with radiotherapy on CNE 2 cell autophagy and apoptosis in nasopharyngeal carcinoma (NPC).Methods Human NPC CNE were divided into blank control group (only 2 cell lines with medium, without the addition of cells) and radiotherapy group, ApoG2 group, combination group (radiotherapy + ApoG2), to determine the treatment sensitizing effects on cell growth of ApoG2+ radiation by using the method of CCK was 8, Hoechst 33258 staining was used to observe the changes of cell apoptosis morphology of autophagy, observe the morphological changes of acridine orange staining; cell apoptosis rate changes were detected, Western bolt detection were used to detect the expression of Beclin1, Bcl 2 protein changes.Results There was significant difference of cell proliferation inhibition rate between different radiation dose group (P<0.01),withtheincreaseofradiationdoses,nasopharyngealcarcinomaCNE2cellinhibitionratealsoincreased;differentApoG2drugconcentrationgroupamongthecellproliferationinhibitionratealsohassignificantdifference(P<0.01),withtheincreaseofdrugconcentration,CNEinhibited2nasopharyngealcarcinomacellrateincreased. 4groups’CNE2cellsapoptosisrateofrevealedsignificantdifferenceswithingroups(F=140.2,P<0.01),apoptosisrateofcombinedgroupwassignificantlyhigherthantheother3groups(P<0.01). 4groupsofBcl2 (F=71.24,P<0.01),Beclin1 (F=107.53,P<0.01)proteinexpressionwasstatisticallysignificantdifferencesbetweengroups,thejointgroup’sBcl2proteinexpressionwasthelowest,theexpressionofBeclin1proteinwasthehighest.Conclusion ApoG2 combined with radiotherapy can through autophagy and apoptosis induction of nasopharyngeal carcinoma CNE 2 cell to inhibit the proliferation of CNE 2 cells.

ApoG2; Nasopharyngeal carcinoma; CNE2 cells; Autophagy; Apoptosis

100048 北京，解放军海军总医院耳鼻喉科

孙建军，E-mail:jjsun85@sina.com

2014-12-10)