橙皮素对转化生长因子-β1诱导心肌成纤维细胞增殖的影响

胡哲夫，唐其柱，刘源，李金，张文斌



论著·基础

橙皮素对转化生长因子-β1诱导心肌成纤维细胞增殖的影响

胡哲夫，唐其柱，刘源，李金，张文斌

目的 探讨橙皮素(HES)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导心肌成纤维细胞增殖的影响，并探讨其可能的机制。方法 取SD大鼠30只，取其心肌组织进行成纤维细胞的培养。而后采用TGF-β1(10ng/ml)刺激成纤维细胞，采用4种不同浓度梯度的HES(25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L、100μmol/L)干预成纤维细胞24h，以台盼蓝染色检测其对细胞活性的影响；荧光酶标仪检测法用于检测细胞内活性氧(ROS)的水平；活细胞计数试剂盒(CCK-8)用以检测成纤维细胞的增殖情况。结果 台盼蓝染色结果提示，HES对成纤维细胞的细胞活性无显著影响，各组活性值分别为空白对照组：100%，HES25μmol/L组:95%，HES50μmol/L组：94%，HES75μmol/L组: 93%，HES100μmol/L组:93%。酶标仪检测结果表明，与空白对照组相比，TGF-β1可增加成纤维细胞内ROS的水平(P<0.01)，当HES与TGF-β1同时作用时，ROS水平随着HES浓度的增加逐渐降低，均存在统计学意义(P<0.05)；TGF-β1可刺激成纤维细胞增殖(P<0.01)，当HES(100μmol/L)或N-乙酰半胱氨酸(NAC)(1mmol/L)与TGF-β1同时作用时，可明显抑制成纤维细胞增殖(P<0.01)。结论HES可通过抑制TGF-β1诱导的氧化应激进而抑制心肌成纤维细胞增殖，提示其对于预防心肌纤维化可能具有潜在效果。

橙皮素；转化生长因子-β1；成纤维细胞；细胞活性

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.04.014

在心肌肥厚及心肌纤维化的过程中，常伴有成纤维细胞的过度增殖和胶原分子的大量分泌，而纤维化的持续进展会导致心肌收缩及舒张功能障碍，心律失常以及室壁顺应性降低，最终可导致心力衰竭[1～3]。既往研究表明[4～6]，转化生长因子-β1(TGF-β1)具有促进炎性反应、氧化应激、纤维化等作用，且TGF-β1可显著促进成纤维细胞的增殖及细胞外基质的沉积。橙皮素(hesperotin,HES)是一种二氢黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抑制肿瘤生长、抗血小板聚集等多种生物学功效[7，8]，但其在心血管系统中研究尚少。因此本研究拟用TGF-β1刺激心肌成纤维细胞的增殖，并以HES干预，观察HES是否对TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖产生影响，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 出生1～7 d的SPF级雄性SD大鼠30只,购自武汉大学动物实验中心[动物合格证号:SCXK(鄂)2008-0004]，饲养于武汉大学人民医院实验动物中心SPF级动物室[使用许可证号：SYXK(鄂)2004-0027]。动物实验的操作均参照美国《实验动物管理和使用指南》， 且经过武汉大学人民医院动物管理和使用中心的批准。试剂：橙皮素(上海融禾医药科技发展有限公司)，DMEM/F12培养基(上海立菲生物技术有限公司)，新生小牛血清(NCS)、双抗(青霉素+链霉素)、0.125%胰蛋白酶消化液(美国Gibco公司)，TGF-β1(美国PEPROTECH公司)，2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)(美国Sigma公司)、CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所本)。

1.2 成纤维细胞的获得及培养 取 SD大鼠以75%的乙醇浸泡数秒，对其颈部以下消毒， 抓取小鼠，固定四肢，由颈部沿左锁骨中线剪开胸腔，暴露心脏后将心脏完整剪下，置于已在冰台上预冷的含有 DMEM/F12培养基和20% NCS的培养皿中，清洗2次后，将组织剪成约1 mm3大小，转移至含有转子的培养瓶中，加入0.125%的胰酶，在37℃恒温磁力搅拌器中消化10 min后将里面的胰酶吸出弃去(因第1次消化下来的有很多杂细胞)， 再次加入胰酶， 消化10 min后将胰酶吸出转移至50 ml离心管内， 同时向离心管中加入1.5倍体积的含有20%NCS的DMEM/F12 培养基终止消化。再向培养瓶中加入胰酶，重复操作3次，直到心脏组织变小变白。用50 ml离心管离心，弃去上清后重悬，将悬浮液使用40 μmol/L过滤网过滤后分装至已经采用0.1%明胶包被的培养皿中，差时贴壁1.5 h后移去培养皿中上清，重新加入新鲜培养基后继续培养，24 h后再次换液。细胞培养在37℃恒温、体积分数为5%的CO2培养箱中，采用含有20%NCS和1% 双抗(青霉素+链霉素)的DMEM/F12培养基培养细胞。使用对数生长期的细胞，当细胞密度达到约80%后，使用0.125%的胰酶消化并以1∶2的比例传代，每次传代时细胞密度控制在1×105/ml。

1.3 细胞活性检测 实验分组：空白对照组，HES 25 μmol/L组，HES 50 μmol/L组，HES 75 μmol/L组，HES 100 μmol/L组。将细胞接种至6孔板中，采用不同的处理因素处理成纤维细胞24 h后，使用0.125%的胰酶消化细胞并小心吹打，使其成为单细胞悬液，分别吸取10 μl细胞与10 μl台盼蓝置于60 μl离心管混合后，再次吸取10 μl混合液放置在细胞计数仪检测板上对其进行检测，计数仪自动读取数据。将空白对照组设为参考值100%，其余组数值与之对比即得出相对细胞活性。本实验重复3次，取平均值。

1.4 ROS的检测 实验分组:空白对照组，单加TGF-β1组(10 ng/ml)，TGF-β1(10 ng/ml)+ HES(25 μmol/L)组，TGF-β1(10 ng/ml)+HES(50 μmol/L)，TGF-β1(10 ng/ml)+HES(100 μmol/L)组。将细胞均匀接种至96孔板中，每孔100 μl，置于温箱继续培养24 h，细胞密度达到80%后将培养基更换为无血清的培养基饥饿24 h，然后采用不同处理因素干预24 h，将96孔板中的培养基换为含有10 μmol/L的DCFH/DA 的培养基继续孵育20 min，之后将培养基吸出，用PBS清洗3次，以排除未进入细胞内部的DCFH/DA的干扰。最后再次加入PBS 100 μl，置于酶标仪下检测，激发光波长为485 nm，发射光波长为525 nm。ROS 水平(%) =干预组荧光值/空白对照组荧光值×100%，将空白对照组设为参考值100%，其余组ROS水平与之对比即得出相对ROS水平。本实验重复3次，取平均值。

1.5 细胞增殖能力测定 实验分组:空白对照组，单加TGF-β1组(10 ng/ml)，TGF-β1(10 ng/ml)+ HES(100 μmol/L)组，TGF-β1(10 ng/ml)+ NAC(1 mmol/L)。将细胞均匀接种至96孔板中，每孔100 μl，置于温箱培养24 h后将培养基更换为无血清的培养基饥饿24 h，采用不同处理因素干预 24 h后，将培养基换为含有10 μl CCK-8的无血清培养基100 μl，继续在温箱中孵育2.0～2.5 h后置于酶标仪下检测(波长450 nm)。转化率=干预组细胞的增殖平均值/空白对照组细胞的增殖平均值将。将空白对照组设为参考值100%，其余组数值与之相对比即得出增殖相对比率。本实验重复3次，取平均值。

2 结 果

2.1HES对细胞活性的影响 台盼蓝染色结果提示，4组不同浓度梯度的HES干预成纤维细胞24h后细胞活性分别为HES25μmol/L组:95%，HES50μmol/L组：94%，HES75μmol/L组: 93%，HES100μmol/L组:93%，与未加任何处理因素的空白对照组(100%)相比，差异无统计学意义。见图1。

图1 HES对成纤维细胞活性的影响

2.2HES对ROS产生的抑制作用 与空白对照组相比，TGF-β1刺激成纤维细胞24h后可显著增加细胞中ROS的产生(P<0.01)；当TGF-β1与HES同时处理时，可呈浓度依赖性地抑制ROS的产生(P<0.05)。见图2。

图2 HES可抑制ROS的产生

注：与空白对照组比较，aP<0.05；与TGF-β1组比较，bP<0.05

2.3HES对TGF-β1诱导细胞增殖的抑制作用 与空白对照组相比，TGF-β1可显著刺激成纤维细胞的增殖(P<0.01)；而TGF-β1与HES(100μmol/L)同时使用时，与TGF-β1组相比，则可显著抑制细胞增殖(P=0.017)；TGF-β1与NAC(1μmol/L)同时使用时，同样可以抑制细胞增殖(P<0.01)。见图3。

3 讨 论

本研究发现，TGF-β1可诱导心肌成纤维细胞的氧化应激损伤，增加胞内ROS的水平。而不同浓度的HES与TGF-β1同时作用于成纤维细胞后，胞内ROS含量明显低于TGF-β1组(P<0.05)，且呈现浓度依赖性，即随着HES药物浓度的增加，对ROS的抑制作用逐渐增强。本研究还发现TGF-β1能够刺激成纤维细胞的增殖，而HES与TGF-β1同时作用时可显著逆转这种现象；NAC作为一种ROS活性抑制剂，同样能够抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞增殖[4]。因此，推断HES通过抑制心肌组织成纤维细胞的氧化应激来抑制细胞增殖。

图3 HES对TGF-β1诱导成纤维细胞增殖的抑制作用

注：与空白对照组比较，aP<0.05；与TGF-β1组比较，bP<0.05

心肌纤维化是一种常见的心血管系统并发症，常发生于各种心肌病中[9]。纤维化的持续发展会弱化左室收缩及舒张功能，进而引起射血分数降低，左心功能不全，甚至会导致终末期心功能衰竭[10，11]。而成纤维细胞的增殖与心肌纤维化的发展密切相关，因此控制其增殖对于有效地提高心功能至关重要。

HES作为芸香科柑橘属植物的主要成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗癌及抗微生物等多种生理作用[7，8]。在心血管系统中，HES还具有降脂、抗血小板聚集、舒张血管等功效，从而维持心血管系统的正常生理功能[7，12]。

研究表明[13]，氧化/抗氧化失衡是引起机体内氧化应激损伤的重要原因。大量产生的ROS如过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(·O2-)、羟自由基(·OH)等都可与体内大分子物质如核酸及蛋白质分子反应，破坏细胞或组织的正常结构及功能从而引起损伤[13，14]。既往大量实验证实[1,3,15]，TGF-β1可通过促炎、促氧化应激等途径引起多个组织器官中ROS的活化及成纤维细胞的增殖，如肺脏、肾小管上皮、心肌组织等。这些学者均认为，ROS是直接促进成纤维细胞增殖的重要因子，并且ROS可通过多种途径来刺激成纤维细胞的增殖并分泌胶原分子进一步促进组织器官的纤维化。因此控制成纤维细胞中ROS的水平对于其增殖能力十分关键。许多研究者认为，ROS在机体内是一把双刃剑，在正常生理条件下，机体内ROS的产生和降解处于一种动态平衡，一旦受到促炎因子刺激，ROS的清除能力减弱，进一步引起内皮细胞的炎性损伤及功能障碍。少量的ROS作为胞内的重要信使分子起到了一定的积极作用，但过量的ROS可介导炎性反应或氧化应激，引起血管内皮的损伤从而引起心血管系统疾病。Liu等[4]认为，TGF-β1可刺激机体多个组织器官产生ROS，而ROS能够进一步反馈性活化TGF-β1，从而进一步刺激成纤维细胞的增殖和细胞外基质的沉积。该研究表明[4]，在成纤维细胞中，TGF-β1不仅可通过活化胞中的NOX4分子并刺激线粒体及微粒体中H2O2的表达，还可激活下游的Smad2或Smad3分子进而促进心肌组织发生上皮向间质转化(EMT)，使成纤维细胞大量增殖并迁移；另一方面，TGF-β1增加心肌组织中产生大量的ROS，并降低谷胱甘肽、过氧化物酶、谷氧化蛋白等抗氧化物的水平，降低心肌组织抗氧化损伤的能力；此外，大量的ROS可激活MAPK信号通路，使pERK、p38、pJNK等大量表达，引起各种促肥厚及促纤维化分子表达增加，有利于成纤维细胞的增殖而进一步引起心肌纤维化。

本结果表明，TGF-β1可提高心肌组织内成纤维细胞中ROS的水平并诱导细胞增殖，当HES与TGF-β1同时作用时可逆转以上现象。说明HES可抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞氧化应激，从而抑制细胞增殖。证实了HES可通过直接抑制心肌成纤维细胞中ROS的产生从而发挥抗心肌成纤维细胞增殖的作用，从而可有效地抑制心肌纤维化的发生发展，这为HES将来的临床应用提供了一定的基础实验依据。但本次实验局限于细胞水平，未研究动物在体实验，心肌纤维化的其他标记物也尚未检测，因此存在一定的局限性，HES具体的分子机制仍需要进一步阐明。

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Effect of hesperetin on cardiac fibroblast proliferarion induced by TGF-β1

HUZhefu,TANGQizhu,LIUYuan,LIJin,ZHANGWenbin.

DepartmentofCardiology,RenminHospitalofWuhanUniversity,HubeiProvince,Wuhan430060,China

TANGQizhu,E-mail:qztang@whu.edu.cn

Objective To investigate the effect of hesperetin (HES) on transforming growth factor-β1(TGF-β1) cardiac fibroblasts induced cell proliferation, and to explore its possible mechanism.Methods 30 SD rats were included; take the myocardial tissues to culture the fibroblasts. And then uses the TGF-β1(10 ng/ml) to stimulate fibroblast cells, with 4 different concentrations of HES (25 μmol/L, 50 μmol/L, 75 μmol/L, 100 μmol/L) to intervene fibroblasts for 24 h, blue staining was used to detect the effect on cell viability by trypan; enzyme-linked fluorescent immunoassay testing method was used for the detection of intracellular reactive oxygen species (ROS) level; living cell counting Kit (CCK-8) was used to detect the proliferation of fibroblasts. Results Trypan blue staining results indicated that, HES had no significant effect on fibroblast activity in cells, each activity values were blank control group:100%，HES 25 μmol/L group: 95%，HES 50 μmol/L group: 94%，HES 75 μmol/L group: 93%，HES 100 μmol/L group: 93%，enzyme mark instrument results show that, compared with the blank control group, TGF-β1can increase the level of ROS in fibroblast cells (P<0.01),whenHESandTGF-β1haveeffectatthesametime,ROSlevelsdecreasedgraduallywiththeincreaseofHESconcentration,therewerestatisticalsignificance(P<0.05);TGF-β1couldstimulatetheproliferationoffibroblasts(P<0.01),whenHES(100μmol/L)orN-acetylcysteine(NAC) (1mmol/L)andTGF-β1haveeffectatthesametime,theycaninhibitfibroblastproliferation(P<0.01).Conclusion Through inhibiting TGF-β1induced oxidative stress, HES can inhibit the proliferation of cardiac fibroblasts, which suggested that it may have potential for the prevention of myocardial fibrosis.

Hesperetin; Transforming growth factor β1;Fibroblasts; Cell activity

中央高校基本科研业务费专项基金资助项目(No.2012302020212)

430060 武汉大学人民医院心血管内科

唐其柱，E-mail:qztang@whu.edu.cn

2015-01-04)